猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较分析

1、JAASIVMADCprotocol第1页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较试验方案猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较参考编号试验的日期动物试验 开始日期2014-动物试验完成日期2014-实验室试验开始日期2014-实验室试验 完成日期2014-动物试验 地点实验室试验地点江苏省农科院兽医所试验负责人邵国青动物试验 负责人冯志新、熊祺琰、华利忠动物试验参 与者甘源、王佳、徐飞扬、陈财实验室试验负责人冯志新、熊祺琰、华利忠实验室实验参与者：冯志新、熊祺琰、马庆红、陈财、王佳试验方案起 草人冯志新、熊祺琰、华利忠试验方案讨论参加者邵

2、国青、刘茂军、冯志新、熊祺琰试验方案疋稿人及时间2014-记录的附件 页数JAASIVMADCprotocol第2页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较目录猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较 1猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较 1目录2猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较 31目的32材料与方法32.1材料322方法42.2.1动物分组说明42.2.2动物分组与试验操作概表 52.2.3 免疫62.2.4疫苗免疫后临床症状观察记录 72.2.5疫苗免疫后血清抗体及分型检测 72.2.6疫苗免疫后细胞免疫指标检测 72.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指标检测 72.2.8

3、攻毒7附录1攻毒保护率计算9附录2猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准 10附录3动物分组记录表11附录4动物免疫记录表 12附录5免疫后异常临床症状观察记录表 13附录 6抗体检测记录表 14附录7淋巴细胞增殖试验结果 16附录 8血象分析 17附录9T淋巴细胞分类计数 18附录10黏膜抗体检测记录表 19附录 11攻毒记录单 20附录 12特殊情况记录表 21附录13攻毒后临床症状观察记录表 22附录14日增重记录 24附录 15攻毒后肺部剖检记录 26附录 16攻毒后剖检记录 28附录17攻毒后肺部病理损伤记录 30附录18攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测 32JAASIVMADCpro

4、tocol第3页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较1目的猪支原体肺炎活疫苗AN306菌株与原168菌株的肺内注射免疫效果比较; 猪支原体肺炎疫苗（天邦、吉林正业、辉瑞）免疫效果比较；2材料与方法2.1材料2.1.1待试的疫苗产品与试剂2.1.1.1 疫苗A. 猪支原体肺炎活疫苗 AN306株F321，由江苏省农业科学院兽医所研制，规格为2X 107CCU瓶（2ml 冻干）,批号为 20140325c 有效期： 。 PCR鉴定:Mhp,Mhr。B. 猪支原体肺炎活疫苗（168株），由南京天邦生物科技有限公司提供，规格为50头份/瓶，

5、批号为139078-1。有效期： 。PCF鉴定:Mhp，Mhr。C. 猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株），由吉林正业生物科技有限公司提供，规格为4头份/瓶，批号为2014002。有效期：20150110D. 猪支原体肺炎灭活疫苗（P-5722-3株，Suvaxyn RespiFend MH），由上海硕腾（辉 瑞）提供，规格为50头份/瓶，批号为1302777A有效期：15/11/16_2.1.1.2试剂A.猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株）稀释液 ,批号：2014002;有效期：20170115 B猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液C.猪支原体肺炎肌注活疫苗佐剂 G-1-15-10日龄仔猪，54头.2.

6、1.2动物选择猪肺炎支原体抗体、抗原均阴性的饲养地点：江苏省农科院兽医所饲养员： 徐飞扬，陈才仔猪免疫状况：未打气喘病疫苗。2.1.3动物饲料仔猪料： 2.1.4设备JAASIVMADCprotocol第4页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较气雾免疫设备、滴鼻头、20 （10、5、2） ml注射器、耳标、耳号钳、冰盒、相机、 解剖器械、离心管。2.1.5攻毒用强毒猪肺炎支原体强毒JS株组织强毒，来自本所，批号 20130625, -20 C保存，有 效期至：2014/06/25 。2.2方法2.2.1动物分组说明G1:-猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组。每头猪

7、肺内注射免疫1头份（1ml）即1X 107 CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。G2:-猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组。每头猪肺内注射免疫1ml,即卩1X 107CCU的猪支原体肺炎活疫苗 AN306株。 免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。G3:-猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。每头猪气雾免疫5X 107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。免疫一次，6 周后攻毒，攻毒后28天剖杀。G4:-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。每头猪肌肉注射免疫5X 107 CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。首免后两周二免，一免后6周攻毒，攻毒

8、后28天剖杀。G5:-猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。每头猪肌肉注射免疫1头份（2ml）猪支原体肺炎灭活疫苗。首后 2周，加强 免疫一次，首免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。G6:-猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。每头猪胸腔注射免疫1头份（5ml）猪支原体肺炎乳兔活疫苗。免疫一次， 一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。G7:-猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。JAASIVMADCprotocol第5页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较每头猪滴鼻免疫？头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，6周后攻毒, 攻毒后28天剖杀。G8:-健康对照组（不免疫，不攻毒）。不接种疫苗

9、。不攻毒，其它组攻毒后 28天剖杀。G9:攻毒对照组（不免疫，只攻毒）。不免疫疫苗，只攻毒，攻毒后 28天剖杀。222动物分组与试验操作概表组号组别N疫苗剂量DPI-0DPI-7DPI-14DPI-21DPI-28DPI-35DPI-42DPI-70G1168肺内组6天邦1x 107CCU/ 头（1头份）肺内免疫/采血/鼻拭子/称重鼻拭子采血/鼻拭子鼻拭子采血/鼻拭子鼻拭子采血/ 鼻拭子/ 攻毒/称重剖检/称重G2AN306肺内组6ADC1X 107CCU/ 头G3168气雾组6天邦5X 107CCU/ 头气雾免疫/ 采血/鼻拭子/称重G4168肌注组6天邦5X 107CCU/ 头肌注免疫/

10、采血/鼻拭子/称重肌注免 疫/鼻 拭子采血/鼻拭子G5灭活苗组6辉瑞2ml/1头份G6乳兔苗胸腔组6吉林正业5ml/1头份胸腔免疫/ 采血/鼻拭子/称重采血/采血/鼻拭子鼻拭子G7乳兔苗滴鼻组6吉林正业1头份滴鼻免疫/ 采血/鼻拭子/称重G8健康对昭组八、yI L6-采血/鼻拭子/称重G9攻毒对昭组八、yI L6-称重攻毒/称重JAASIVMADCprotocol第6页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较总计54223免疫G1 猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组用灭菌生理盐水50ml溶解168活疫苗冻干粉1瓶，使活疫苗终浓度为1X107 CCU/ml，1头份/ml

11、。每头猪肺内免疫1ml，即1X 107 CCU/头。G2猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组用灭菌生理盐水溶解 AN306活疫苗冻干粉，使活疫苗终浓度为1X107CCU/ml。每头猪肺内免疫1ml，即1 X 107 CCU/头。G3:-猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。将1瓶168株活疫苗用5ml无菌猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液溶解稀释成1 X 108CCU/ml浓度，取5ml疫苗溶液倒入喷雾器，对保温箱中的6头仔猪 进行气雾免疫（0.2MPa,约10min）。G4:-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。将1瓶168株活疫苗用25ml佐剂G-1-1溶液稀释成2X 107CCU/ml浓

12、度， 每头仔猪颈部肌肉注射免疫2.5ml，注射时分左右侧肌肉共2个注射点。首免 后14天二免，方法同上。G5:-猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。按猪支原体肺炎灭活疫苗说明书，每头猪肌肉注射免疫1头份猪支原体肺炎 灭活疫苗。G6:-猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。按猪支原体肺炎乳兔活疫苗说明书，每头猪胸腔免疫1头份猪支原体肺炎活 疫苗。G7:-猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。每头猪滴鼻免疫？头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。G8健康对照不免疫G9攻毒对照不免疫JAASIVMADCprotocol第7页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效

13、果比较2.2.4疫苗免疫后临床症状观察记录免疫后观察并记录可能出现的临床症状，填写附录3。尤其要记录如下重要的症状：咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤、死亡等2.2.5疫苗免疫后血清抗体及分型检测除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、免疫后 2、4、6周取3头猪各采血1ml （两次 免疫组于首免前、首免后3、4、6周采血），分离血清，用自制P46-ELISA试剂盒检 测IgG抗体。对于阳性者继续用分型试剂盒检测 IgG亚类。2.2.6疫苗免疫后细胞免疫指标检测除攻毒对照组外，其余各组于首免后2、4、6周取3头猪各采集抗凝血 5ml （两次免疫组于免疫后3、4、6周采血），其中1ml用于血液

14、生化检测；1ml用流式细胞仪检测 CD4+T细胞、CD8+T 细胞含量、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+/CD8+比率；另外 3ml用于淋巴细胞增殖试验和IFN-丫检测2.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指标检测除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、首免后7、14、21、28、35、42天采集鼻拭子样品，检测吸呼道特异性sIgA抗体。2.2.8 攻毒将每瓶猪肺炎支原体组织强毒用50ml生理盐水稀释，气管途径接种试验组试验猪，每头5ml。2.2.9攻毒后临床症状观察所有猪在攻毒后按附录2要求观察临床症状 2.2.10日增重计算各组分别选定3头猪，不采集血样，分别于首免当天、攻毒当天和剖杀当天称重,计算日

15、增重JAASIVMADCprotocol第8页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较2.2.11攻毒后肉眼病变剖检所有仔猪在攻毒后的第 28天进行宰杀，记录肺病变，用28分法统计确定肺病变程度, 并记算攻毒保护率（见附录1）。2212攻毒后病理损伤观察剖杀后，采集所有猪左尖叶，福尔马列林溶液固定后，切片观察病理损伤。2.2.13攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测剖杀后，每头猪用50ml生理盐水采集肺泡灌洗液，用定量PCR方法检测猪肺炎支 原体抗原。JAASIVMADCprotocol第9页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较附录1攻毒保护率

16、计算攻毒保护率的统计与评判：试验猪扑杀后，分别记录左尖叶、左心叶、左膈叶、 右尖叶、右心叶、右膈叶、副叶病变百分比率，将 025%记为1; 2650%记为2; 5175%记为3; 76100%记为4,统计每个试验猪病肺病变指数（最高为 28）。试 验猪病变指数大于10判为发病，小于4为健康（排除猪肺炎支原体感染），根据肺病 变指数，按以下公式计算试验猪攻毒保护指数。试验猪攻毒保护指数二（攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值-试验猪肺病变指 数）/ （攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值-不攻毒不免疫对照组肺病变指数平均 值）试验猪攻毒保护指数小于60%为无保护，大于或等于60%为有保护，再按以下 公式

17、计算试验猪攻毒保护率。试验猪攻毒保护率二有保护试验猪数/试验猪数试验在阳性对照组全部发病、阴性对照组至少全部健康时有效。JAASIVMADCprotocol第10页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较附录2猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准评判参数01210最高分咳嗽无有严重2呼吸困难无有严重2呕吐无有严重2俯卧无有严重(躺卧)2食欲不振无有1震颤无有1死亡无有10注射后第1日(D1)直肠温 度咼出范围1.0 C以下1.0 C1.5 C1.5C以上2注射后第2日(D2)直肠温 度咼出范围1.0 C以下1.0 C1.5 C1.5C以上2注射后第3日直肠温度较 对照组高

18、出范围0.5 C以下0.5 1.0C1.0C以上2累计总分28猪安检试验中，每头试验猪症状全部累计， 总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全,累计总分25,可重检1次，重检累计总分不大于 2安全。JAASIVMADCprotocol第11页 共32页编号：10-3-10猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较附录3动物分组记录表猪场：农科院组别头 数标记耳号G1 168肺内组G2 AN306 肺内组G3 168气雾组G4 168肌注组G5灭活苗组G6乳兔苗肺内组G7乳兔苗滴鼻 组G8健康对照G9攻毒对照JAASIVMADCprotocol第12页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免

19、疫效力研究附录4动物免疫记录表动物免疫日期:组标记疫苗免疫途径剂量猪（头数）G1 168肺内组G2 AN306 肺内组G3 168气雾组G4 168肌注组G5灭活苗组G6乳兔苗肺内组G7乳兔苗滴鼻组JAASIVMADCprotocol第13页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究附录5免疫后异常临床症状观察记录表组：猪数:日期：标记:猪号观察日期第几日JAASIVMADCprotocol第14页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究附录6抗体检测记录表组别耳标DPI 14/21DPI 28DPI 42igG亚类IgG亚类IgG亚类G1G2G3G4G5JAAS

20、IVMADCprotocol第15页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究耳标DPI 14/21DPI 28DPI 42igG亚类IgG亚类IgG亚类G6G7G8G9JAASIVMADCprotocol第16页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究JAASIVMADCprotocol第17页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究JAASIVMADCprotocol第18页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究JAASIVMADCprotocol第19页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究JAASIVMA

21、DCprotocol第20页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究附录11攻毒记录单攻毒株：批号：来源：稀释液：批号：来源:在实验室稀释 日期：管（毒液）批号量稀释ABCDEF动物攻毒日期:组猪（头数）攻毒途径剂量耳号G1G2G3G4G5G6G7G9操作人：复核人:JAASIVMADCprotocol第21页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究附录12特殊情况记录表日期：观察：组：隔离器：签名：日期：观察：组：隔离器：签名：-如有特殊情况，比如转群，疾病，用药，换料等影响动物的事件。填写“附录12:特殊情况记录”注：试验负责人员（SGQ, LMJ）应定期现

22、场核查饲养情况，以及攻毒后的临床症状等， 并在临床观察以及饲养记录上签字及日期。及时将原始数据传递至 JAAS，便于沟通。JAASIVMADCprotocol第22页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究附录13攻毒后临床症状观察记录表组耳号临床症状记录与评分症状类型评分G1G2G3G4G5JAASIVMADCprotocol第23页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究组耳号临床症状记录与评分症状类型评分G6G7G8G9JAASIVMADCprotocol第24页 共32页编号：10-3-10猪气喘病疫苗的免疫效力研究附录14日增重记录组别耳标DPI 0DPI 42DPI 70日增重人重总重猪重人重 |总重猪重人重总重