非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶制备清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干（制胶用玻璃板为硫 化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、 量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻 璃板上）；将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻 璃板滴少量100临醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士 林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条 的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；配胶（8%非变性聚丙烯酰

2、胺凝胶，Acr:Bis=:1 ）、灌胶；将以下母液按量混合均匀保存于 4C, 一般一周内用完，溶液120ml240ml40%Acr24ml48ml2%Bis10XTBE 12ml 24mlddHO针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧 杯，加入适量10%AP（催化剂）和TEME（加速剂），摇匀，灌胶， 缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固;（注：1聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒， 凝固后无毒，因此操作时 应戴上手套；2板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生 胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为（宽）x

3、（高）x1mm厚），配制如下：胶混合液10%APS TEMED一板胶30ml180a L80a L两板胶60ml360口 L160a L制胶及电泳（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和 清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%L醇擦拭。1用12 ml 95%勺乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、 均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2 3次）2用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面， 用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦 23次）3用加样枪取1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正 面，用纱布涂抹均匀；（擦

4、至感觉特别光滑为止）4用1ml 95%勺乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可 使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）5检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取 的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻 璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于 边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板 的两侧；以1X TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝 固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。(2) 制胶：称取尿素21g,加入17ml双蒸水加热约二三十秒溶 解，待冷却后加入 10

5、ml 5XTBE冰浴至冰手时加入 40%丙烯酰胺(19:1 ),然后加入2251 10%硫酸铵和50卩I TEMED快速混匀， 准备灌胶。(3) 灌胶：用5ml加样枪将制备好的胶液沿玻璃板中部缓慢加 入到胶板玻璃板之间的空隙，注意不能在胶中形成气泡(要多次实验 以掌握技巧、控制加样速度、调节玻璃板倾斜度、手按、竖起玻璃板、 便轻敲变加样等)。胶灌满后，将鲨鱼齿的平端插入胶液下 5mm左右(不可过深，以免后面不能加样；也不可过浅，以免上样量过小) ， 同时防止梳齿平端下方出现气泡，于室温下静置 2h,使胶完全聚合 后使用。(4) 预电泳：撕去胶布，两端平行用力拔出梳齿，将玻璃板和梳齿上的多余凝胶

6、擦洗干净，用蒸馏水漂洗玻璃板、梳子。将玻璃板 装到电泳槽上，在下方电泳槽中加入1X TBE至没过玻璃板下端约1cm装好电泳槽，加入1X TBE至没过玻璃板上端约处，用梳齿刮去 玻璃板间隙间的碎胶，再用5ml加样枪将其吹干净，反转梳齿，将鲨 鱼齿插入凝胶胶面下约，并用夹子夹紧，梳齿间空隙即为加样孔。120w 恒功率，预电泳30min。(5) 点样：点样前用加样枪吹吸每个上样槽，将梳齿间隙间油状液体吸干净，以利于样品更好的沉降。把DNA羊品与上样缓冲液混 合，每个加样孔加57卩1的扩增产物。(6) 电泳：140-160W恒功率电泳，待溴酚蓝至胶的四分之三处 时(大约需要2h),终止电泳，回收电泳液

7、(可重复用一段时间，当 发现电压下降很多时要更换电泳液，或者补加蒸馏水可继续用一段时 间)，取下胶板，将两块玻璃板轻轻分开，凝胶留在长玻璃板上。银染显色当第一染料接近胶底边缘，电泳结束，也可使第一染料跑出；关闭 电泳仪，移去夹子，取下玻璃板，将胶从玻璃板上小心取下，切 去一角或两个角作为记号，以便于辨认，然后开始银染处理，处 理均在摇床上进行，具体步骤如下：分钟10%醋酸(Fix/stop solutio n)20纯水15分钟滋肖酸银（染液）30分钟纯水10-20秒左右显影液(Developer soluti on, 4-10C)显影适当定影液（3%或10%昔酸，加几滴甘油）5 分钟包胶注：定

8、影液一一将胶在 10%勺醋酸中处理结束，可向醋酸中加入 少许甘油（防止胶在干燥过程中发生胶裂），摇匀，直接用作定影液； 银染中应注意事项： 水的质量对染色效果影响极大，一般用超纯水或双蒸水，如果水 含有污染物，胶可能不显影或仅仅显上部条带；而下部空白； 显影液中碳酸钠的纯度也很重要，建议使用无水碳酸钠； 由于温度过高，显影太快，所以为了便于控制显影过程，一般将显影液储存于4C,用时取出；显影液在4C长期放置容易结晶,一般使用前1-2天配制即可，显影液配制方法如下：终浓度NaCO（无水碳酸钠）50g100g100g/L50mg/ml硫代硫酸钠160 卩 L/L(Sodium thiosulfat

9、e)80a L160a L甲醛(Formaldehyde)1ml2ml试剂名称500ml1000ml2ml/L（注：50mg/ml硫代硫酸钠溶液应于-20 C保存） 在10%的定影液加入几滴甘油，可以用作最后的显影液； 每一步都应该轻微摇动，一般在摇床上进行； 银染后在无离子水中的冲洗时间要求十分严格，一般在 10秒左 右，应小于20秒，如果超过20秒，应重新在的硝酸银重新染30分 钟； 的硝酸银溶液可以重复使用6-7次，每次适当延长银染时间，最 后可以在废弃银液中加入 NaCl，使银以AgCL沉淀，过滤或重力沉淀 即可以回收银； 因为不容易清洗，所以装硝酸银、显影液和固定液及定影液的盆不 能混用； 电泳结束后，涂抹凡士林的玻璃板、板条用热水浸泡后，用纸擦去 凡士林，再清洗时比较容易洗净，或浸泡后用洗洁精清洗即可。7 包胶将包胶用的玻璃板洗净， 玻璃纸提前泡在水中