NBQX对脑缺血再灌注后成年大鼠大脑少突胶质前体细胞的保护作用

1、文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持.NBQX对脑缺血再灌注后成年大鼠大脑少突胶质前体细胞的保护作用作者：李华杰吴坚盛世英朱林凤张菊美【摘要】目的探讨脑缺血再灌注后成年大鼠大脑少突胶质前体 细胞的变化及MK拟801和NBQX对其保护作用。方法以线栓法制作成 年SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型（阻塞90min再灌注Id、7d和14d）, 分别向其大脑皮质缺血区立体定向注射5mmol/L的MK拟801和50 mmol/L的NBQX各1 U 1,用免疫荧光组织化学法检测脑缺血再灌注后 成年大鼠早期大脑梗死中心区、梗死周边区和缺血对侧NG2和04阳性 细胞数量。结果脑

2、缺血再灌注后成年大鼠大脑皮质梗死中心区NG2 和04阳性细胞逐渐减少，NBQX组大鼠NG2和04阳性细胞数减少的 幅度较少。脑缺血再灌注后梗死周边区NG2和04阳性细胞数逐渐增加, BQX组大鼠增加更明显，而MK拟801组与生理盐水组无明显差别。结 论 成年SD大鼠脑缺血再灌注后梗死周边区少突胶质前体细胞增多。 BQX对少突胶质前体细胞早期的缺血性损伤有保护作用。【关键词】缺血;再灌注;少突胶质前体细胞;NBQX【Abstract 】 Objective To explore the change of oligodendrocyte precursor cells in aduIt rats

3、 after focal cerebral ischemia and the protection of MK拟801 and NBQX to them Methods Focal cerebral ischemia and reperfusion model in male aduIt SD rats was established by occluding the right middle artery with 4拟0 nylon thread （blood flow blocked for 90 minutes and then reperfusion for 1 day, 7 day

4、s and 14 days One microliter MK拟801 (5mmol/L) and NBQX (50mmol/L) were respectively injected into the cerebral ischemic area of SD rats under stereo拟directional instrument right after ischemia Then NG2, 04 拟positive cells in the ischemic core, ischemic penumbra and contralateral area of rats were de

5、terminated at each time拟point after reperfusion by immunofluorescence his to chemistr y. Results The number of NG2 , 04 拟 positive cells within the ischemic core decreased significantly at each time拟point with the NBQX group in less amount The number of NG2 and 04拟positive cells within ischemic penu

6、mbra increased gradually after reperfusion with the NBQX group in higher amount. Conclusion The marked increase of oligodendrocyte precursor cells is observed in the peri 拟 infarct area during the post拟ischemic reperfusion period in the aduIt rat brain. And XBQX has some neuroprotective effect to ol

7、igodendrocyte precursor cells in post拟ischemic brain injury.【Key words Ischemia; Reperfusion; 01igodendrocyte precursor cells; NBQX兴奋性氨基酸毒性损伤作用是脑创伤和脑卒中等中枢神经系 统(central nervous system, CNS)疾病中神经元死亡的主要因素之一 1 o 而少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPC) 膜上含有大量的兴奋性氨基酸受体2 MK拟801和NBQX分别是N拟甲 基拟D拟天冬氨酸（

8、N拟methyl拟D拟aspartate, NMDA）受体和a拟氨基 拟3拟疑基拟5拟甲基拟4拟异卩坐丙酸盐 （a1pha拟am ino拟3拟hydroxy拟5拟me thyl拟4 拟 isoxazole propionate, AMPA）受体的拮抗剂。我们观察了脑定向注射MK拟801 和NBQX对大鼠脑缺血再灌注后早期大脑皮质NG2和04表达的影响， 报道如下。1材料和方法1.1动物和分组成熟雄性SD大鼠（苏州大学实验动物中心 提供）280320g,共60只，随机分为正常对照组（缺血前）、生理盐水 组、MK拟801组和XBQX组，缺血再灌注后Id、7d及14d共10个小组, 每组6只大鼠。1

9、.2动物模型制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型制作参照 Kitagawa H3的方法，用4拟0的无创单股尼龙手术线由近端向远端 插入颈总动脉、颈内动脉，至大脑中动脉起始段，由此造成大鼠局灶 性脑缺血，于90min后拔除尼龙线，开始再灌注。对照组麻醉后分离 岀右侧颈总动脉，然后缝合。麻醉及手术期间使大鼠肛温保持在37 37. 5Co大鼠清醒后具备以下表现者为动物模型制作成功，记入实验 组：大鼠朝左侧转圈爬行，或者左前肢无力并向左侧方爬行3。XBQX组和MK拟801组大鼠脑缺血后即刻在KOPF TAXIC500900 型立体定位仪下分别向其脑内缺血区注射NBQX（50 mmol/L）和 MK拟801 (

10、5mmol/L)各1叮，注射速度0. 2 H l/min5。生理盐水组大 鼠依照上述方式注射1 U1生理盐水。1.3组织标木制备用3. 6%水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉 后，经主动脉先后灌注4C的生理盐水和4%多聚甲醛300ml,然后断 头取脑，4%多聚甲醛室温下固定2h, 30%蔗糖溶液过夜，用冰冻切片 机连续冠状切取10 Um厚切片。1.4NG2、04检测 采用免疫荧光组织化学间接法，先后加一 抗，小鼠抗大鼠NG2 IgG、小鼠抗大鼠04 IgM,二抗，兔抗小鼠 IgG+M拟FITC(华美生物工程公司)，然后在荧光显微镜下观察NG2、04 阳性细胞形态并计数。1.5NG2、04阳性细胞计数将

11、缺血再灌注的冠状面前冈处脑 组织浸入2%氯化拟2, 3, 5拟三苯基四氮哇(TTC)溶液中，37C避光孵育 30min,如图1所示，图中所示的梗死中心区)、梗死周围区(b)及梗 死对侧区(c)随机选取5个200倍视野，记录NG2.04阳性细胞的数量, 每只大鼠选取三张连续切片，计算每只大鼠NG2、04阳性细胞算术平 均数，以个/视野表示。1.6统计学分析所有资料均用土s表示，均数比较采用方差 检验，以P<0. 05为差异有统计学意义。2结果2. 1NG2、04阳性细胞形态及分布特点 正常对照组大鼠大脑 皮质分布数目较多的NG2、04阳性细胞，另外，脐月氐体和皮质下白质 等其他区域也有较多

12、的NG2、04阳性细胞。NG2表达在0PC的细胞膜 上，NG2阳性细胞荧光显微镜下呈黄绿色，形态较小，直径20um左 右，呈圆形、椭圆形或梭形（图2） ;04也位于未成熟少突胶质细胞膜上, 04阳性细胞体积比NG2阳性细胞略大，形态呈圆形或椭圆形（图3） o2. 2梗死中心区NG2、04阳性细胞数变化 在200倍显微镜视 野下，各组大鼠大脑梗死中心区每视野内NG2、04阳性细胞平均数见 表1。脑缺血再灌注后成年大鼠大脑皮质梗死中心区NG2和04阳性细 胞逐渐减少，NBQX组大鼠NG2和04阳性细胞数减少的幅度较少。2.3梗死周围区NG2、04阳性细胞数变化 在200倍显微镜视 野下，各组大鼠大

13、脑梗死周围区每视野内NG2、04阳性细胞平均数见 表2。脑缺血再灌注后梗死周边区NG2和04阳性细胞数逐渐增加,NBQX 组大鼠增加更明显，而MK拟801组与生理盐水组无明显差别。3讨论OPC泛指从少突胶质祖细胞到未成熟少突胶质细胞之间的一 系列细胞，这是一个连续的过程。成年动物脑内的少突胶质前体细胞 占所有神经细胞的5%8%,在人脑中所占的比例还要大4。近年来 研究发现，少突胶质细胞对缺血缺氧等刺激同样敏感，尤其是其前体 细胞，脑缺血再灌注引起的能量耗竭、氧化应激同样会损伤少突胶质 前体细胞5。NG2是表达在少突胶质祖细胞膜上的一个糖蛋白，是少突胶 质祖细胞的特异性细胞标志物;04是表达在未

14、成熟少突胶质细胞膜上 的一个脂质抗原，是未成熟少突胶质细胞的细胞标志物4。木研究结 果显示，脑缺血再灌注后早期成年大鼠大脑皮质梗死中心区NG2和04 阳性细胞数逐渐减少，且非常显著，可能是脑缺血再灌注后产生的细 胞因子、自由基以及过多的兴奋性氨基酸使得表达髓鞘蛋白基因的少 突胶质细胞死亡或凋亡而减少2, 5。OPC细胞膜上有较多的兴奋性氨基酸受体，主要为非XMDA受 体，包AMPA受体和红藻氨酸受体2。脑缺血以后，由于神经细胞损 伤使得兴奋性氨基酸释放增加，细胞外积聚了大量的兴奋性氨基酸， 使得兴奋性氨基酸受体过度兴奋，兴奋性氨基酸受体的过度兴奋是引 起少突胶质前体细胞损伤的重要途径loIK拟

15、801和XBQX分别是NMDA 受体和AMPA受体的拮抗剂，二者都有较好的水溶性，定向注射到脑内 后能很快扩散到周围脑组织，浓度分别为5mmol/L和50mmol/L的 MK拟801和NBQX在脑内能充分的阻断NMDA受体和AMPA受体2, 6。 研究显示,注射浓度分别<150mmol/L和50mmol/L的NBQX和 MK拟801不会引起注射部位局部非特异性损伤7。本研究结果显示， XBQX组大鼠梗死中心区和梗死周边区的NG2和04阳性细胞数都多于 MK拟801组和生理盐水组，提示脑缺血再灌注后细胞间隙兴奋性氨基 酸增多，0PC膜上的AMPA受体介导了兴奋性氨基酸毒性损伤，而NBQX

16、恰恰阻断了这一途径，减轻了对OPC的缺血性损伤，引起NBQX组NG2 和04阳性细胞数相对增多。因此，兴奋性氨基酸可能参与了 OPC缺血 后的损伤过程，运用兴奋性氨基酸受体拮抗剂可能是缺血性脑损伤的 脑保护途径之一。表1梗死中心区NG2、04阳性细胞数比较 与生理 盐水组比较，*P<0. 05;与MK801组比较,#P<O. 05表2梗死周 边区NG2、04阳性细胞数比较与生理盐水组比较，*P<0.05;与 MK801 组比较,#P<O. 05【参考文献】1 许绍芬主编.神经生物学M.上海：上海医科大学岀 版社，1999： 202拟209.2 McDonald JW,

17、Althomsons SP, Hyrc KL, et al. Oligodendrocyte from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate :receptor拟mediated excitotoxicityJ Nat Med, 1998, 4(3) :291 拟297.3 Kitagawa H, Sasaki C, Sakai K, et al. Adenovirus拟mediated gene transfer of glial cell line拟derived neurotrophic factor prevents ische

18、mic brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in ratsJJ Cereb Blood Flow Metab, 1999, 19 (6): 1336.4 Baumann N, Dinh DP. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous systemJ Physiol Rev, 2001, 81:871927.5 Dewar D, Underhill SM, Goldberg MP. Oligodendrocytes and ischemic brain injuryJJ Cereb Blood Flow Metab, 2003, 23 (3):263.6 Massieu L, Tapia R. 2,3 Dihydroxy 6 nitro7 sulfamoyl benzo(f)quinoxaline protects ag