SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理和操作步骤

1、SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、 快速、而且可重复的方法。 该法是依据混合蛋白的分子量不同来 进行分离的。SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。 在样品介质和凝胶中加入强还原 剂和去污剂后， 电荷因素可被忽略。 蛋白亚基的迁移率取决于亚 基分子量。试剂和器材： 试剂： 1. 5x 样品缓冲液（ 10ml） : 1mol/L 的 Tris-HCl,5ml 50% 甘油，2ml 10%

2、的SDS巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，蒸馏水。可 在4 C保存数周，或在20C保存数月。2.凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺， 加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4C保存，般可放置 1个月。3.分离胶缓冲液：Tris，加1mol/L HCI 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调，定容至100ml,4C保存。4.浓缩胶缓冲液：Tris,加 1mol/L HCI 48ml,加重蒸水 80ml使其溶解，调，定容至100ml,4C保存。5. TEMED （四乙基乙二胺）原液 %硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris，甘氨酸，

3、加蒸馏水 约900ml，调后，用蒸馏水定容至1000ml。置4C保存，临用前稀 释10倍。8.考马斯亮蓝 G250染色液：称100mg考马斯亮蓝 G250,溶于 200ml蒸馏水中，慢慢加入70%的过氯酸，最后补足水到250ml, 搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。SampkWell1-(ipcaQn phDiphqrykivti Hvin* wv m tlbum n弭JOODirectionofmigralion45 QOO31 OCM1.4W电M UnhEvn uMrdiid* erstfiii实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与 5X 样品缓冲液（ 20ul

4、5ul ）在一个 Eppendorf 管中混合。放入100C加热5 - 10min,取上清点样。二）分离胶及浓缩胶的制备 1 将玻璃板、样品梳、 Spacer 用 洗涤剂洗净，用 ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干； 2 将两块洗净的玻璃板之间加入 Spacer ，按照 Bio-Rad Mini /m说明书提示装好玻璃板;3 按如下体积配制 1 0分离胶 ml ，混匀； ddH2O mlmol/LTris-HCl pH= ml 30% Acr-Bis ml 10% SDS 80 ul 10%AP 56 ulTEMED 6 ul 4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约 20 min 后 胶即可聚合;5 按 如 下 体 积 配 制 6 浓 缩 胶 ml ， 混 匀 ; ddH2O mol/LTris-HClpH= 30% Acr-Bisml 400 ul 600 ul 10% SDS 10% AP TEMED 36ul 24ul 4ul 6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳;7装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 U I;8稳压200V,溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min 1hr.9卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色12 h