混合酸酐法总汇

1、1. 2 1混合酸肝法合成百草枯人工抗原（1）取前期合成的 百也枯半抗原（PQh） 16 mg溶于600 yL二噁烷中，搅拌使其 溶解。然后加入无水三正丁胺70 gL.将此混合物在4 C冰浴 中冷却，并搅拌15 mm,加入朿蒸的氯甲酸异丁酯30 gL.4 C左右搅拌30mm。（2） 52 mg B$A溶于4. 5 rnL水中，川 0. 1 mol.L的NaOH调pH至9. 0。将上述PQh溶液逐滴加入 到溶解的蛋白中，并于4 C轻微搅拌4 h,整个过程维持pH 在9 0。然后，将混合物于4*CM 0. 1 mol.L pH7. 4的PBS中 透析72 h,每隔6h换透析液1次。冷冻干燥后于20

2、 C保/Zo用同样的方法合成包瀚I原 PQ-h-OVA：5,o克百威包被抗原的合成利用混合酸酹法 将50 A41101/L半抗原（BFNH或BFNB）溶解在 1 niL的DMF中,然后在该溶液中加入等当暈 的正三丁胺和氯甲酸乙酯,在室温下反应1 h 后,取反应液500匹 加入到5 rnL 15 mg/nL 的BSA碳酸缓冲溶液中，然后在磁力搅拌下反 应2h 待反应完成后装入透析袋先用蒸懈 水透析2次,然后用0. 8%生理盐水透析，最后 采用紫外扫描测定结合比分装保存于 20 C 的冰箱中2.2 DES-BSA及DE&OVA的合成及鉴定 参照 混合酸酹法7】进行。取50 mgDESrHS溶于适量

3、 二氣六环中，置4 C下10 mm 加入适量三正丁胺， 混匀后再加入适量氯甲酸异丁酯，于4 C磁力搅拌 30 min ,作为甲液。同时称取300 mg BSA溶于适 量的50 %二氧六环水溶液中，作为乙液。将乙液在 4 睹解预冷后倾入甲液中，在4 C条件下搅拌过 夜。反应液川0. 85 %的NaCl溶液在4 C透析72 h,然后冷冻干燥。于20 C保存。用紫外吸收光 谱法及聚丙烯酰胺电泳法鉴定DES-BSA，并推算 BSA与DEVHS的做联率n2.DES-MCME-BS A复合物的合成； 取97mg DES-MCME溶于6.5ml二氧六环 中，加入55 M三正丁胺，冷至4*0（冰浴）， 再加入

4、40 氯甲酸异丁商，反应30min, 为甲液另取330mg BSA溶于18ml 50%二 氧六环水溶 液（含200 |il IN NaOH ）中. 为乙液.将甲液倾入乙液中，用IN NaOH 调整pH至8.0左右，41C搅拌反应（过夜）。 反应液对流 水透析72h后.，用IN HC1调整 pH至4.2,即产生口色沉淀，4匕冰箱过夜， 次日离心（2000 Xg. 15min, 4 1C ）取沉 淀，用5%後酸氢钠溶液溶解厉，冰冻干燥. 得DES-MCMEBSA 265mg.紫外 光谱 分析，BS A 的入为 280 nm , DES- MCME-BSA 的匕.为 260nmoHiaH-DES 柿

5、释法测得每个BSA分子上约结合35 个DES分子.LSL2 NT与蛋白质的偶联过程Z免疫抗原的制备采用混合酸酉f法（Mixed Anhydride methods, MA）与载体蛋白（BSA）偶联。取lOOmg反应产物用lml N,N二屮基屮酰胺搅拌溶解后，加人15ul三乙 胺，49下反应lh。随后加人4 5P1氯甲酸异丁脂，继 续反应lh称取218mg BSA溶于2ml水屮，用lnol/L氢 氧化钠凋pH到8. 5左右，加人1ml N, N二屮華屮酰胺， 4 9下搅扌半反应1人然后逐滴滴加上而反应好的产物， 边滴加边搅拌，被活化的在竣基在碱性条件卜与蛋白质 的游离氮基反应生成酰胺键，4 C条

6、件下再反应约4h 用双蒸水透析2d,期间多次换液，最初两次用PBS透 析，后两次用蒸備水透析，冷冻干燥保存。其合成路线如下：(CHhCOOCOOCHiCONOMT-CMA-BSAI(2 )混合酸肝法氯看素-半琥珀酸 酯(CAP-HS)的制备：取2gCAP.适量*H -CAP和865mg琥珀酸肝溶于15门1无水毗症 中，置60C温箱中反应24小吋：常液呈紫红 色.取出冷却至室潼，WAimcl冰盐酸中， 静置沉逹，过滤并洗涤沉逹，601C烘干，得 氮策素半琥治酸凿(CAP-HS )CAP -4S-E&A复合物的合成：取153.5mgCAP -HS(其中含一定晁的8H-CAP-HS)，溶 于10ml

7、二甲基甲酰胺(DMF)中，置4C 下lOmin,加入85 U三正丁胺.混合.再 加入63卩1氯甲酸异丁殆，磁力搅拌，4t, 30min.为甲液。场此同时取638mg BSA溶于18ml 50%DMF水溶液中，预冷至 4匸，置冰浴上不断搅拌，用lmol/L NaOH 调整pH为8.0,为乙液.随后，迅速将乙液 加入甲液中，继续搅拌反应4小时(4C )。 反应物对牛理盐水透析72小时，得CAP- HS-BSA复合物。如前所述，用同位素稀释 法测定BSA与CAP的偶联率,、用紫外光谱 法定性检验CAP-HS-BSA.一苏廿红I旳分于结构个具有和5曰仙収的沽住 基团、所以合成带有锻基的苏丹红I是与载体蛋白 仙取的基础，将前期实验合成的苏丹红I衍生物川 混合酸肝法合成免疫抗原苏丹红ITH胶。具体步 骤如厂称取10mg苏丹红I衍生物溶于0. 2molZl 氧六环(1,4dioxane),加入氯甲酸界丁酯7gL, 18 C 120 r min振摇40mui.此为A溶液。另称取 明胶40m溶于1. 1111L硼酸缓冲液(pH 9 0