BCA测蛋白的具体操作步骤培训讲学

1、BCA 测 蛋 白 的 具 体 操作步骤精品文档一. 原理BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一 BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为120微升。二. 试剂盒组份 组份Cat: KGPBCA (250 assay酶标板/50assay 1mL比色杯)蛋白标准溶液(0. 5卩g/) L5 mL BCA试剂A 25 mLX2 BCA试剂B 1mL三. 操作步骤A.酶标板操作1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照

2、下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7蛋白标准溶液(uL 0 1 2 4 8 12 16 20去离子水(20 19 18 16 12 8 4 0对应蛋白含量(yg 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0孔号01234567蛋白质溶液(uL01248121620去离子 水(uL2019181612840相应蛋 白质含 量(ug)00.512468102. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50:1)配制 适量BCA工作液，充分混匀;3. 各孔加入200卩L BCAX作液;4. 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec 37C放置30分钟，然后在

3、562nm下比色测定。以蛋白含量（yg为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20 yL加入BCA工作液200yL充分混匀，37r放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在 562nm波长下比色，记录吸光值；6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（y除以样品稀释液总体积（20yL，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：y g/ yLoB.分光光度计测定1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂 孔号0 1 2 3 4 5 6 7蛋白标准溶液 （ y L 0 5 10 20 40 60 80 100去离子水（yL 100

4、 95 90 80 60 40 20 0对应蛋白含量（yg 0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.02. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B （50:1 ）配 制适量BCA工作液，充分混匀;3. 各管加入1000 y L BCA工作液；4. 各管充分混匀，37T放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（yg为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100 uL加入BCA工作液1000uL充分混匀，37C放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在 562nm波长下比色，记录吸光值；6. 根

5、据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（ug，除以样品稀释液总体积（100uL，乘以样品稀释倍数即为样品实际 浓度（单位：u g/讥。四. 注意事项1. 配制好的混合BCA工作液室温24小时内稳定。2. 加入BCA工作液后，也可以在室温放置 2小时，或60E放置30分钟。 BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升 高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。3. 待测样品浓度在502000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。4. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS, 5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80=但受螯合 剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保 EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏 糖醇低于1mM，3巯基乙醇低于1mM.不适用BCA法时建议