RACE中文说明书

1、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit User Manual libk or Contents码 L概要简介II 成分m .另备物品IV. BD SMART RAE AmpliRcaLn 基本康理引物设计VL Poly A* t RNA和总RNA的制备vn. cDNA的弟一密的舍成vm pat阳，性对豐QC3N碌端的快速扩ifl (RACE) 1X. RACE产物鉴定XL疑难解答501 参考文献xm 相关产吕附录加5 -RACE流程图示附录皿3-RACE图示PH 录 C; SupprffiHoa PCR and StetMJiH PCR 39I 简要概述II.

2、成分列表Comral Hunun PLicenialTolal RNA 和 BD SMART IIA 01ig3nuLlcoddott-70fiCT 保存。NudeoTrap Gel Extraction Kit 2ST 保存.其条试笊-20临下保存.fig BD SMART RACE btrind cDNA 含成7jil BD SMART IT A OUgonueleotide (12 pM)5-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGTACGCGG (Tf7pl 3-HACE CDS Primer A (305; 12 pM)5-AAGCAGTGGI7VTG.，AGG GAGAGTA

3、CfTJJOV N-3*arT V = A, G, or C)7pl 5-RACE CDS Primer (5CDS; 12 pM)_ 茴小 5TD25VN-3* (N = A, C, G 曲戸 V 二 A, C, orC) 7pl BD PoiverScrlpl Reverse I-anscriptaM 200 pl 5X FirabSLrdnd Buffer250mMTHs-HCI (pH 83)375 mM KC130 niM Mgpl2200 pl DJthiothreitol (DTT; 20 mM),二硫苏權醉 lml Deianitzecl H205& 3 -RACE PCR 4

4、00 pl 10X Universal Primer A Mix (UPM)Long (0. 4 pM):5 -CIAAIACGA TGACTXrAGGGCAAG-CAGTCGIATGAACGCAGAGT-3 Short (2 pM):5- 4ATACGACTCACTATAGGCC- 50 pl Nested Unh ersal Primer A (NUP; 10 pM5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT7Control Reagents 5pl Coatrol Human Phcental (胎盘)Total RNA (1 pg/pl) 25 pl Control 5 -RAC

5、E TR Primer (10 pM) 25 pl Control 3 RACE IVR Primer (10 rM)General Reagents70 pl dNTP Mix (dAl dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)2Xlml lkine-EDTA Buffer10 mM Tricine-KOH (pH & 5)1.0 mM EDTANudeoIYap Gei Extraction Kit (CaL No 636053 or K3070y) 100 pl NudeoTrap Suspension3 ml NT1 Buffer 10 ml NT2 B

6、uffer2ml N13 Buffer User Manual (PT316d-l)Free Lrial-size BD Advantage 2 PCR Kh (Cat No. 639207or K1910-y)Tho BD Advanuge 2 kit provider suf fie ieni roagenls for 30 PC R reactions.The following a)m|Xnenls are included: 30 pl SOX BD Advantage 2 Polymerase Mix200 pl 1 OX BD Advance 2 PCR Buffer 30 pl

7、 SOX dNTP Mix (10 mM S) 30 pl Control DNA Template (100 rT/pl) 30 pl Control Primer Mix (10 pM each) 1 ml PCR-Grade Wator User Manual (PT3281-1)III.另备物品下列试刑襦另外准笛； 0. 5-1 nl PCR 反应管.推荐使用 PerkinElnier GeiwAmp 0. Sml fXMClion tubes (dl.N8ai-0737ufN001-0180). Mineral oil (. g., Sigma CdL Na M-3516)俺小IV

8、BD SMART RACE 的要点使全面闻读所有妙锻均经过优彳匕 但可能因所使用的辭、根版、引物和然循环仪而不同因此应使 用 Control Human Pldceeiul TOLlI RNA5RControl T- an订 3 - RACE TF*R Prinwns 进行烦 实RACE PCR的效率取决试腌样品RNA中mRNA的丰盛另外ig火温愷和延伸遍I也依引韧 不同而变化.诗参照第X节的侵议优彳匕PCR的条弁丑进行5f-RACE and 3RACE PCRK必别便用热启动。本手册巳经过优仏 所便用 的BD Advantage 2 Polymerase Mix中包含BDTaqSurt抗体用

9、于目动逬行PCR的热启动 （Kellogg etal., 1W4）.也可以手” （D*Aqu订aet al., 1991用第珠（Chou e70。（2可获得堪好的结果（可便用felJltouchdownPCR根版、引物 及RACE产物如图?所示.至少福要两个特冥引物才能进行完整的BD SMART RACE： B0用于S-RACE PCRBtJ反义引物和用T3-RACE PCR的IE义引物。如 果只进行5 取丁 RAUE则只 需一个特异引梅。引物长康在23-2E个核音酸，长于30个核言酸没有优势.如囹3所示，两种引物的idARACE扩増产物存在部分里気如果在星燮区有一个合适 的限制性前切位点，可

10、以逸过酶切和连搔反应可以得到0JNA的全长。将两个引物设计应 其RACE产物有106-20W） p的匿整的形式，就能够民舍使用作为叱R反应的B 口性炖風引 捌并非一定要设计成较得星聖片断的形式対于大或稀有dJNJU.引物启好雯设计的尽盘邪 近cDNA的末附 不产生垦爱此外.引挖目身可以工聲（$0互卄）特异引物GC含为 50-70% ,拭至少 65o 口使用 1 心窗 neighbor 分析（Freier etal. x 1%G;我们便用 Primer Punier?件来计鼻Tm Tm.应尽可能大于粮据我们旳经验.氏引物旳退火温厦高于70。匸待别从困难的样品中可以得到强旳RACE旷Tm-s超过7

11、C可臥使用WJSPCRo此外GSPL和GSP2设计成興有相似的Tm将更有利于使用。通过计 算或试验能够得封GSP1和GSP2的TmS曼邂免使用内部互补的引物或引物之 何互补的引 物.尤具在引物旳;T末端互注意土不更将刮切位点都舍井到5和3羽异引柯的5侏ML根据找们的经验.这些191外的圧列将会增加反应呼象，wwrbfEBT k* ZEflv -4VWA*VJUVV7L-* sSSWg5AAMwt?A/UyVMAAAAA JTT*T. fFigure 3. The relationship (rf gene-spedJic primers to the cDNA templateB 引籾在基因上

12、Affifi尽首我们使用BD SMART RACE Kii成功地得到了穴于65 kb扩增产挤 但为了使你旳5 和RACE产物达劃2 kb,建议対引物加以第选C. P9 EtouchdownPCR我们发現WSPCRCDunotal., 1991; Roux, 1995）明显填加BD SMART RACE扩增的待 异性*阵 落PCR的退火温度符合苜次PCWS坏的Tm高于通用引物的Tnujfl果你的特异引初Hm在这 空循环中将只有与墓因特异性箔合旳引柄炭生液合从而积累一定盘的特定产物。退火 温度在隨后降低到与通用引物相配合的視度.引起特异性基因模版 旳!8数和高效率的扩 紅当你的引物旳T m （rc

13、时我们雄荐使用隠落很环程序.D 奧式引物在苜次试验时不費便用黑式兀2洌合旳週用引物（M）和基因特异引物CGSP ）通何能得到较好的低的非特异性背JR的RAX产物但是.里式特异引物可以作为 糅针在鉴定RACE产物的Southern blowing中使用。此外祟式PCR在使用特异引物进行5 or 了.RACE存在高背K* 口 E待异性扩增时有必使風 在臬式PCR中.使用 外側引物 进行一个初步的扩增如果扩増产Wffilffi不淸.可以使用内部引恂至新扩増初步产物的 一部分.BD SMART RACE包括了可选的步瑕，描明了卑式引物能林被便用的地方。本试 齐！ I盒提供的通用巢式引物A可用于S -

14、and*RACE.按照上述指南可以tft计翼式特异引物。翼貳引物与外侧特异引物尽可能不璽乞.如果因 序列有限而必须更叠其内部引物的3末箱旳序列也更尽可能唯一VI总RNA和Poly A+ RNA的制备九总的預防OficDNAft成质H的首毀因索就是总RNA和poly A* RNA旳完楚度和疑显 下述預防 措施 可使你昭免RNA的隠解和污嶷.直授使用子水没有用DEPC处理。.用0. 5NNa0H*所有旳玻璃蛊皿，160_180。(2烘烤49 hr.使用一次性吸还吸头.R.RNA分离BD BicjHdences Clonledi提供儿种ii剂盒用于RNA分禺和纯彳匕JQNudeoBu订d RNA/D

15、NA Mini Kit (Cal. No. 635945).C. RNA分斯推荐使用变性甲IS琼脂电泳检测RNA样品。哺轧动極的总RNA展示为两祭4. 5利1.9 kb的带，分别对应2BS和18S核糯体RNA,它们之间的总度比率釣为1-2：1.硒乳动物 的Pdy A* RNA金产生0. 5-12 kb的弥散带亮度较核81体RNA带弱.Sixx? distrilutlai) nwy be smdller with noninainrndllaii tissue bourccs.VII. cDNA的第一链台成如下所迷，两个10的反应可以将50 ng-1 pg总RNA ffipaly从RN八转換成用

16、于RACE的 cDNA的第一链。我们传荐尽址使用polyMRN仏 但是如果总RNA的fll少于50 pg,则不直进行poly人4RNA的 斃化，否则E终产很小将金彫响分折RNAJSM和质为菽得長好的试验结果.可以便用1隔的 poly A4 RNAJK1 曲的总 RNA.我们强烈推荐便用包括Human Placatal Total RNA在内的试箜样品逬行阳性对照cDNA的合 成.该cDN八将衾被用于阳性对照的R入CE反血L在0. Jnl微型离心皆中加入T列试刑：For preparetjon o( 匸 RACE-Ready cDKA RKA sample 1 pl 7-GOS prmer AF

17、or pieparation of5 RA. CE Ready cDNARNA sample*1 ill 5*-CDS pnrw1 ill BD SMART IIA oligo取 1 pl 的 Control Human PlaceiUdl Total RNA (1 pg/ji.)fF 为对照合成2.加入 消毒水至终体积为匕pl 3-混合并在小型离心机上短暂風心.4. 70 C 下追育 2mino5. 迅連在冰上冷却2 min06短gft/b便成份衆集爸堆7.在無个反应管中再D0AT列试剂(巳有体积):2 p 5X Firsl-Straiid Buflfer面小1 pl DTT (20 mM)

18、ridNTPMix(10 mM)1 pl BD Pg&Scripl Reverse TrartSCripLiJie总体积为10 plB小心混合皆内组分9垣暂离心使成份聚集省应10. 42 C下潟育15hr.注越：使用水浴或热個环仪会由于蕖发作用而眸低反应液的体积，由此眸低第一毡的合成 枚率。11. tt用THCgEDTA Sg冲液來烯釋反应产物：如果以腔OOng的总RNA开始反应，可加入2011僚稀阪如果以=200 ng的总RNA幵始反应.可tJOAlOO plJR释心如果以poly从RNA幵站反应可加入250 pl来稀释12. 72 CTU0S7mln 或 PCR Kit (CaL Nos.

19、 &39119 & 639120)0 for subsequent analysis. For applicatiotis in which tile higliesl fidelily pruducl is desired, rnplaWs up to 3. 5 kb.For mon? hifomwtioii, see Section XI CYoubleshooling Culde).1. 为所有的PCR反应和1个额齐旳反应准备足审的主混會液.対于毎个50. pl PCR反应.混合下列试刑：34.5 pl PCR纯度的水5 gl 10X BD Advanyge 2 PCR Buffer1

20、pl dNTP Mix (10 mM; in BD SMART RACE 或 BD Advantage 2 PCR Kil)1 pl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix总体积为41. 5 pl2. 濮凋暹合(龙泡沬产生)，疸暂离心。3按表2进行PCR反应的准备按顺序SEOEIPCR青中加入各种成份轻爲It .EIMG UP THF P05ITWF CONTROL RACE FXPERINFN1Tube Mo r#M- rlptkni：Goniporwfii1V. RAC rCFW1TRACTControl3 IrelmMControl (5* cOhA4Cont

21、rol pr cOHA)CmM S -RACCReals-cDKA23 Ml25 udJ RAC* R lyA5? aj5-RAGE TFR PnmWM1 1 Ml1 J、KA；ir rRPrtfw(W*M)1 1 III1 UPW10X5 J& JHQ4 id4 dlAMWr Am41 S Hl41 5 ij415 id41 SHniliol nw50 Ml50 d50 ml50 d2 (得29 3OHQ3 34胡管加入2淞旷切油厦盖加盂。注竄：如果使用熱羞傭环仪则可以不用矿物油。5 技下列程序启动阵落PCR 5 (rycfosM C 307 AC 3 mm 5 cycleswc 30 MC

22、7 (rc 30 siec7RC 3 mn 27 cycteWC30sc6MC30sec*7 XC3mm6.毎样取5 pl在1.2%凉膾桓漫胶上进行电泳分析。其余45 pl保存在-20。Go理想的试验结果(泳道2和5所示” S-RACE对照应当产生一条2 kb带.3. RACE対愿反应 应当产主一条2.4kb带.如杲没有观察到这些带出现.将各PCR反应査慶新股回到 循环仪中. 再进行5次循环。如果仍然没有朋望的带岀现.益照第X帀的疑难解答一定真 在阳性对照 反应能密在42个或更少的遁环次数内(5 cycles diuieallng dt 72 C + 5 cycles ul 7SC 32cyd

23、ut68 C).产生了很開显的单祭正确的产物带之后再使用试的引物和dDNA进行正式的 试验.俺小dy-KAGLy-RACEM 12 3PCR反应遲會液的准备：确保混合液体枳足够所有的PCR反应和一次煎外的反应。该 混 合液用于5，和J.RACE反应。对7M-pl PCR5应，所混合的成34. 5 JPCR-Ctode Waler5 J 10X BD AdvsniaQe 2 PCR ButlerI ulJNrPKIix (101SOX H 口 Ac Imritog 2 PolyinprOTC Mm41.6 ul Total volume 2旋周湿含(不委产生气泡) 短暫离心.3対于S- ttAC

24、E:搔袤HI旌备PCR反应：对于丁.RACE】按表IV准备SO. S-ml PCR 中技顺序加入所有成份.轻柔泯合。5 61F igure 4. 5 - and 3 -RACE sample resuIts.本试脸使用总RNA2E行RATE的反应结杲：Lanes. 1 & 4 ：干扰素受体Ld(w 2 & 5：铁转运蛋白受体Ldiwd & 6: HPRT.2和孑逋的RACE产切的穴小为26kh和29kb.铁转运虽白受体的T-. R/XCE (弟)令偶尔 产 生一条06kb的产物IX. cDNA末端的快速扩增(RACE)本部分描述了利用5*. RACE和3 -RACE PCR反应得到3 4Q M

25、 cDNA片段正式iftlftll*按照第 八节所述进行阳性对照试验。虽然阱盒提供7NesteJ Univeisal Primer A(NUP)r但在BD SMART RACE反应中不是定更进行巣式POR。所有的RACE PCR反应祁用BD AdvaiiUge 2 Polymer皿MU进行了 fil优化处f。I/Wlt M： Stn IIP y4MSCormpnnM1 y RACE Simple2 r-TFr (Conlwl)3 GWM C (Corrol)4.UPM only 卜Crntmi)5G5P1 onlyCorrtT)gACEHdd. eDMA2 “2B :2$ *2 5 J2 $d

26、(xpnmentalUPM 110X15 Ml5 5hCSP1 (IDJJ；1 Ml1 1 dGSP2(ICW MTFR1 H1 GSP2 (10kM w1 T1 uiControl r*AC THJ (1C -M4 Hl1 W5 Ml 1 6LbUf Mu415 fil415 pl41S dAl S M)Fmjl volunwM3 “50 pl50 60 *FTOQF” 1 (prMoffrcj ux if GSP HbC) ScydnMX 30 me rrc 3 W 5eyefcWC 30 seet RN*A是非人类的，可以廉过此步t如果待异引物不产生星Q可以規迎此步.有关对照反应的细节够

27、照第XI节一4毋百内復盖初油 ZJUffioN。仏:如使用规盖時环仪则不必加旷物油。5便用T列程序之一启动16环仪.(jxt) grarttt 1和2用于聋和3 -RACE TFR和UPM PrimefsB*阳性对照L依据所使用的ftpoly I还是总RNA来诲择正确的循环次UFO-C 90 weT2 3 mm* ?0 cytMS i P tfy A* RMA)OR 25 (Tote RNAWC ao*c 90 sec72X3 W ffra*wK 3 kB QCM add 3 mznwaadisdttnfu uProorsfn 2 (It GSP T -BC) 20 cyc*s (Poly A

28、- RMA)OR J5 cycles fTota RMWC JO sc8X 30 we处3 W*如果扩增的片段长度3 kb 则毎增加I kb延长L miiu6.冋進如臬本次叱R反应没有严生目的帶如生的艮弥溼带.SJSoudienibbt来验证：a A eDNA probeb. A nested primer as a probe我者.可以便用NUP弓I物和NGSP进行傑式*PCR:a取上述PCR产物5 pl用245 pl TMclz EDTA冲液翱算。b. Sfl 上述步 ISU5：用5 pl RPjI的初圾PCR产拘代昔用于RACE的(DMAs.加入NUP引物ipl、奥式特异引物Progra

29、m 2的踊环为15-20 XX. RACE产物的鉴定RACE产物的鉴定便用3种方法：对比用GSPi和NGSPsW到的RACE产辆：Soiitlirn blotting; (C)克睦和测序.八和D焦要燮式引叛A.対比用GSP5和NGSPs得到旳RACE产辆对于5-RACE反应.将UPM Mix和GSP1得到旳初圾护增产切与UPM和NCSP1得到的扩增产物进行对比3于3*-RACEf辂UPM和CSP2与UPM和NGSP2的犷培产韧讲行对比).当肓名铢茁増带时.生引撫的扩壇亀55当利小些.W中一空带 应当消失.Note:不聂使用 Nested Universal Primer A (NUP).B S

30、outhern Blot Analy 山当RACE产物有多条帚时，fflCSPs或NCSPs制作採针遊行SoudieniWot可以把梶地确认臭正的RATE产物新 通常5LRACE比RACE易出連多祭带.1.琼脂柢凌胶电泳检测RACE产籾.茴小2照相、转尼龙KL3准备探针，探针内不能有GSPI(orG5P2财J?列。可以将NGSP1 (orNGSP2)进行末端掠记如黒GSPa的5和卞产物有匡卸 刘可以用GSP2做探针鉴定亍 RACE 产赫用GSP1嵌探针鬟定BRACE产物。使用cDNA进行D 口彻事或JS机引物扩増都可以制 作探针。4杂交、瞬光、显希.5. 与環脂檯审胶电泳国片进行对比6. 旦得

31、到了目的象帚，便用NucJzTmp 3 ExlTcikx、Kil进行胶回收.分SUNAo CRACE产 物的克隆和测序1使用MucleoTwp GelExuuctlon Kit进行RACE产物的0收和塊化，直接克陸到人类 型的 PCR克璨戰休上。2使用32P后记的NGSP进行63落杂交或从GSP处开始週序.验证克隆的插入对于5二RACE 产初.推存至少撓取,10卑克睦.以便在了沐端获得最穴H的序列。一旦确认克隆内含 有最大的待异基因的栩入子处息可能获取较多的序列数据。可吠猖劃 完整0RF以及 5和乳J1KOptions for generating fulllength cDNA在卄RACE产

32、物进行部分或完全测序之后.用B述方法之一可以得到全长cDNA :1 狠撤QNA的5和3的末金序列设计引挪 以用于5-RACE*cDNA为膜板，进厅 长距离PGR (LD PCR).2克隆更Q性阻和丁. RACE片毂.借助更金区内的限制性即切位点得到全长.XI.疑难解答A：常见的PCR问題GCJUdi根板解决办法：如果PCR产物.特别是FRACE产物.不是頂明旳久小或青;殳有.其原因可能是GC-Rld)模 板.dontech 檢供 Advantage GC 2 Polymerase Mix (Cat No. 639114) and PCR Kit (Cat Ng 639119 &39120)来有

33、效扩壇GGridi模板。然而混合液需要修改以及PClTR可能 更根据棋板 星新选定.想费徊到更多内鶴 iSBIXLAiJYdiiidge GC 2 PCR User Manual (PT331G-1),先用 Advantage 2 Polymerase MixffRACEP如舉你不能得到预期的PCR产物 是由于GC倉尬过咼.再 利用 Advhge GC 2P&ymw 恥 Mix (CaL No. 639114)SERACE. IWItocdKlowii PCR 解决办法： 曼排除降落PCR问题.苜先要改变最烫设定的聒环畚数。久果在G8的最小循环TF肓不出扩 增的目的产韧.将你的加样董从股回PC

34、R仪中再跑7个VS环.如杲产物还耒出现.68 *再加3话个逼环.如果还未成功，更做一次PCR.改变第三个循环的退火湿度从68到65.这一程序非常管用.待别是当你的GSP的TTm擾近70的时候B.第一熬cDNA台成问题在笫一链CDNA合成方褰中潢述旳RT (逆转录反应其实是可以改变旳.处而.有些情况T,比 如说氓的數员彳艮少的稀有转釆子中.在4cDNA合成反应中.将SMARTScribe Reverse Transcriptaseff5fl 从 1 pl9 (少至 0.5 pl 可 lilSSSMARTer 5 -RACE 反瓯的灵歆展分析第一链tDNA的质E如果你怀疑扩增CONAMR旳问昭是由

35、于反转录的朱敗.你可以栓测笫一琏CDXA的质盘 利用32 P 砾记理斥（如杲是来自polyARNA）.要做到这一点.專新做第一 f辻cDNAB成实脸，用1 pl的 0.1 pCi/pl a- 32 P dATP或dCTP取代1 pl水，将产物在确性琼胴越胶 上斃电泳.用放射自 显彩法检测扩増模式，如果第一链CDNA合成成功的话你会岂到扩 增模式与你冏RNA旳产拘 是一样旳哺乳动物NpolyA* RNAftS郁令出现0 S12kb的smDNAffi构中的位盍相一做D其他特别的间题问題可能的原因决办沫丨在阳性克睦扩堵的里 polymerase mbc可能有问題如果帰没用Advantage 2 Polymerase企区中汉有双亲到Mix,专虑拱了 SMARIer RACE方法対RACE站Advaiitae 2 Polymerase Mix是可進择的.一定要确保VLBSJ分中的阳性对照 Q CDNA合成反应可能失败蛋做第一链合成反应，你量好刊用R郭分皓方決检谓陆人念成的质用ITP14rFP2没有象 rna可葩部分輝解取含歹从提斛A帶，但阳性对熙中出现正确的产物利用GSP吐GSP2jg 这个问題可能是由于二圾箱电B33分的对于茗含GC棋板的排除肓聚带.但