常用PCR技术复习进程

1、常 用 PCR 技 术精品文档常用PCR技术Hot start PCR:热启动PCR,是提高PCR特异性和可信度的最好的方法之一。通过阻止温度升 高到变性温度前的PCR反应的发生而阻止引物与基因组 DNA上潜在的高同源 性区域结合引起的错误引发（misprimi ng ）。同时热启动还使引物通过互补区 域碱基配对而扩增产生的引物二聚体量大大降低。热启动PCR可通过三种方式实现：1）手动热启动：配置反应液时忽略一种关键成分（聚合酶、Mg离子或dNTP）,当反应液升温到80C以上或变性温度时再加入。手动热启动操作繁 琐，而且因为增加了一次开盖操作，增加了污染的机会，同时由于管与管间的 加样误差，可

2、能使平行样品间扩增结果产生差异；更简单的手动热启动是在冰 上配置反应液，待热盖升温到变性温度，按下扩增仪的暂停键，立即将反应管 放在仪器上开始反应，当然这种方法的可信度也最低2）将聚合酶用石蜡珠裹（或在反应液上部滴一滴融化的石蜡，待其凝固后，将 聚合酶加到石蜡层的上部）使其与反应液的其它成分分开，直到反应液升温融 化石蜡后，酶才进入反应液中。3）使用热启动DNA聚合酶，这种酶通过化学修饰或与抗体结合，常温下没有活 性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。使用热 启动DNA聚合酶相比手动热启动操作简便，缺点是用热启动 DNA聚合酶的价格较高。Touchdow n PCR:降

3、落PCR,是另一种简单的降低非特异性扩增的方法，可规避对PCR循环条件进行耗时的优化实验。降落PCR过程中，首轮循环的退火温度设置在比引物的 解链温度高出几度，使每个后续循环的退火温度逐渐降到，直到退火温度降到 等于引物的解链温度或比引物的解链温度低几度，后续的循环在此较低的退火 温度下完成，整个程序的退火温度可降低 10-15C。在最初几个循环内，高温使 引物的非特异性结合难以发生，只有同引物互补程度最大的模板序列（很可能 这一序列就是我们感兴趣的序列）才能发生退火事件，因此保证靶序列得到优 先扩增。后续循环降低退火温度可保证扩增效率，尽管最终的退火温度降低到 足以使非特异性产物有效扩增的温

4、度，由于靶分子已经开始指数期扩增，因此 抑制非特异性产物的进一步形成。Nested PCR巢式PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加DNA扩增的特异性。在第一次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两 个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用 可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式PCR在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。Multiplex-PCR :多重PCR,指在一个PCR管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重PCR检测引起遗传疾

5、病的基因突变时，可以同时扩增6个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重PCR基础上发展的Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification（MLPA，多重连接探针扩增技术）使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重PCR耗时的优化步骤。Long PCR（ Long distanee PCR Long range PCR）:长距离PCR，普通的Taq聚合酶一般只能扩增不超过 3-5kb的片段，通过使用 特定的聚合酶和缓冲液成分，来扩增较长的DNA链（10-40kb以上）。长距离PCR时经常会在10-15个循环后，使每个循环的延

6、伸时间都比上一循环的时间 增加10秒左右，以补偿聚合酶活性的损失。Clo ny PCR：菌落PCR，通过PCR手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中，通过PCR预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为PCR反应的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区，因此尽管 插入的序列各不相同，也不影响扩增反应的进行。RT-PCR（ Reverse Tran scription PCR :逆转录PCR,是用来扩增、分离和鉴定细胞或组织的信使RNA (mRNA)的技术。反应由两个阶段组成：1. 使用逆转录酶，通过逆转录反应 “ RT合成与RNA互补的cDNA(comp

7、leme ntary DNA)2. 使用PCR扩增特异性的cDNA。由于PCR的预变性步骤可以用来失活逆转录酶，所以两个阶段可在同一管内完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以单独使用这种酶来完成两步反应。RT-PCR可广泛用于表达图谱分析(用来确定基因的表达)；鉴定RNA转录子的序列，当相关的基因序列已知时，还可进一步知道基因组上外显 子和内含子的位置；检测病毒例如 HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。RACE-PCR ( rapid amplification of cDNA ends):一种RT-PCR方法，当对DNA序列信息了解较少时，使用单个特异性引物加一 个接头引物来扩增c

8、DNA的5端(对应转录的起始位点)或 3端从而产生新的 cDNA，重叠的RACE产物可结合起来产生全长的cDNA片段。DD-PCR (differential display):差异显示技术，用来鉴定不同组织中差异表达的基因。将不同组织的RT-PCR产物用短的、非特异性引物进行扩增，然后在凝胶上比对来源于不同组织的条 带，只在某种组织中才出现的条带被认为是差异表达的。Asymmetric PCR:不对称PCR,可选择性的扩增出靶DNA的一条链，从而用于测序反应或制备 单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的 扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的

9、限制引物的 量要合适，引物量过多，则产物主要是双链DNA ;引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称PCR的基础上发展出Linear-After-The-Exponential-PCR （LATE-PCR，线性指数 PCR），使数量限制的引物比 过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。Assembly PCR（也称作 Polymerase Cycling Assembly或 PCA）:通过使用多个具有短重叠区的长的寡核苷酸来合成长的DNA链的方法。通过寡核苷酸产生一条条正向或反向 DNA链，而寡核苷酸的重叠区则确定链组装 的顺序，因此可有选择性的产生最终的长

10、链 DNA分子。Methylation-specific PCR （MSP）:甲基化特异性的PCR，用于研究基因组CpG岛的甲基化模式。首先是用亚硫酸 氢钠处理靶DNA，使未甲基化的胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物识 别成胸腺嘧啶，然后分别用能区分修饰和非修饰模板的不同的引物来扩增（一 对可识别胞嘧啶引物扩增原来甲基化的模板，令一对可识别尿嘧啶或胸腺嘧啶 的引物扩增非甲基化的模板）。结合定量PCR，可以对甲基化程度进行定量。Ligation-mediated PCR： 连接介导PCR,首先使用小的寡核苷酸接头连接靶 DNA片段，然后选择与接 头结合的PCR引物来扩增未知的靶片段。这一技术

11、主要用在 DNA测序、染色 体步移技术(genome walking)和DNA指纹图谱等。AFLP ( Amplified fragment length polymorphism):扩增片段长度多态性，通过扩增使不同生物基因组呈现不同长度的片段。AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA):机扩增多态性DNA，使用随机寡核苷酸片段来扩增序列未知的靶基因，形成基 因组指纹图谱，用来分析物种的相关性。Variable Number of Tan dem Repeats (VNTR) PCR可变数目串联重复序列P

12、CR，使引物定位在具有长度多态性的靶基因区，通过 在凝胶电泳后对产物的大小进行分析来研究基因分型。Allele-specific PCR :等位基因特异性PCR，设计引物时选择在基因组的多态性区域，使等位基因的 突变定位在(或接近)引物的3端，在严谨的反应条件下，存在错配碱基的引 物不能起始复制，而只有完全匹配的引物才能起始复制，产生的产物因此显示 不同的基因型。In terSeque nce-Specific PCR(ISSR-PCR)一种DNA指纹图谱技术，所选的引物定位在基因组的片段重复区（如 Alu 族），扩增后产生基于不同产物长度的唯一的指纹图谱。In verse PCR反向PCR，允许扩增已知序列侧翼的 DNA区。首先将靶DNA用限制性内切酶 进行多轮消化，然后连接被消化的片段构建环状的分子，引物设计成可从序列 已知的区域向外侧延伸，结果扩增出环状分子上剩余的序列。Qua ntitative PCR（Q-PCR）:定量PCR，用来测定样本中的靶 DNA的量。最初的定量PCR主要是指Competitive PCR （竞争定量PCR）。竞争定量PCR：在反应混合物中加入起始 拷贝数已知的内部对照，对照具有同靶序列相同的引物结合位点，但产生的产 物长度与靶序列产生的产物长度不同，在 PCR过程中对照与靶基因竞争相同的 引物。反应后通过比对对照和靶基因产生的产物量推