饲用枯草芽孢杆菌制剂制备工艺研究

1、西南科技大学本科生毕业论文 iv饲用枯草芽孢杆菌制剂制备工艺研究摘要：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) 是常用的饲用微生态制剂之一，因其具有较高的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，具有较强的生物夺氧能力、耐高温高压、易贮存等特点，对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用，因而被越来越多地研制成饲用微生态制剂。本文以枯草芽孢杆菌为对象，系统地研究了枯草芽孢杆菌制剂的制备工艺，其中包括发酵培养基的优化研究、发酵罐培养研究和发酵后处理促芽孢形成的研究，基本形成了一套完整的生产工艺。结果表明：蔗糖为最佳碳源、蛋白胨为最佳氮源，mgso47h2o和mnso4

2、均对枯草芽孢杆菌的生长有促进作用。通过正交试验确定了最佳的培养基组成为：蔗糖15 g/l、蛋白胨4 g/l、nacl 5 g/l、kh2po4 2 g/l、k2hpo43h2o 4 g/l，mnso4 0.4 g/l、mgso47h2o 2 g/l 、ph 7.0。发酵罐培养验证了由正交试验确定的最佳培养基。采用了两种不同的方式促使芽孢形成：一是加入金属离子促芽孢形成。mn2+对芽孢形成促进作用最强，在mn2+的作用下，发酵液中的最终芽孢形成率达到28.5 %。另一是干燥促芽孢形成，干燥能够极大地促进芽孢的形成，其中尤其以冷冻干燥效果最佳，其芽孢形成率达到95.9 %，喷雾干燥的方式达到93.

3、5 %。在各种干燥促芽孢形成的方式中，冷冻干燥时芽孢率最高，较为理想。而喷雾干燥的芽孢的率也相当高，只是略低于冷冻干燥，且喷雾干燥周期短，操作简单，耗能低，成本也低，适合大规模工业生产。关键词：枯草芽孢杆菌；微生态制剂；芽孢；培养基优化；促芽孢形成research on the preparation process of feeding bacillus subtilis probiotics abstract：bacillus subtilis is one kind of strain which is commonly used in feeding probiotics. becau

4、se of its high protease,lipase and amylase activities, it has a strong biological capture oxygen capacity, tolerance to high temperature and high pressure and easy storage features, which plays an important role in promoting the digestion and absorption of animal nutrition, improving feed conversion

5、 rate of animals, preventing disease and the promoting growth, which has been more and more used to research on feeding probiotics. in this paper, the research object is bacillus subtilis, the preparation formulations of bacillus subtilis probiotics were studied systemly, including the optimization

6、of fermentation medium, bioreactor culture study and fermentation post-treatment to promote sporulation were studied, formed a complete production processes. the results showed that: sucrose is the best carbon source, peptone as the best nitrogen source, both mgso4 7h2o and mnso4 can promote the gro

7、wth of bacillus subtilis. though orthogonal test, the best composition of the medium was been determined: sucrose 15 g/l, peptone 4 g/l, nacl 5 g/l, kh2po4 2 g/l, k2hpo43h2o 4 g/l, mnso4 0.4 g/l, mgso4 7h2o 2 g/l, ph 7.0. bioreactor culture verified the best medium which was determined by orthogonal

8、 test. two different ways of promoting spore formation were used: first, adding metal ions to promote sporulation. the ability of mn2 + promoting sporulation is the strongest, under the promoting of mn2 +, the final fermentation broth sporulation rate reached 28.5%. another way is drying to promote

9、sporulation, drying can greatly promote the formation of spores, especially in the way freeze-drying, the sporulation rate is reached to 95.9%, the sporulation rate of spray-drying is 93.5%. in kinds ways of drying to promote sporulation, the spore rate of freeze-dried is the highest, more ideal. th

10、e spore rate of spray-drying is also very high, only slightly lower than the spore rate of freeze-drying and cycle of spray-drying is short, operation is simple, low energy cost, low-cost, is suitable for large-scale industrial production.key words: bacillus subtilis; probiotics; bacillus; medium op

11、timization; promote sporulation目 录第1章 文献综述11.1 动物微生态制剂概述11.1.1 动物微生态制剂的概念11.1.2 动物微生态制剂的分类11.2 芽孢杆菌类微生态制剂概述31.2.1 饲用芽孢杆菌的特点31.2.2 饲用芽孢杆菌的生理功能41.2.3 饲用芽孢杆菌有待研究的问题71.3 微生态制剂的研究前景81.4 本课题的意义81.5 试验内容简介9第2章 材料与方法102.1 实验材料102.1.1 供试菌种102.1.2 培养基102.1.3 主要药品与试剂102.1.4 主要仪器设备102.1.5 相关溶液配置112.2 实验方法122.2.

12、1 标准曲线的绘制122.2.2 菌种的活化142.2.3 c源消耗量和n源消耗量计算方法142.2.4 摇瓶培养142.2.5 培养基优化单因素试验142.2.6 正交试验优化培养基成分152.2.7 优化条件的发酵罐培养152.2.8 发酵后干燥促芽孢形成172.2.9 干燥后芽孢制剂的保存17第3章 结果与分析183.1 标准曲线的绘制183.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制183.1.2 蛋白质标准曲线的绘制183.2 c源用量和n源用量的初步确定193.2.1 c源用量的初步确定193.2.2 n源用量的初步确定203.3 培养基的单因素试验213.3.1 c源单因素试验213.3.2

13、n源单因素试验223.3.3 无机盐实验233.4 正交试验优化培养基243.5 发酵罐培养动态273.6 发酵后处理促芽孢形成323.6.1 加入金属离子促芽孢形成323.6.2 干燥促芽孢形成34小结与讨论361 液态发酵培养基的优化365 发酵罐培养研究365 发酵后处理促芽孢形成36致 谢38参考文献39 西南科技大学本科生毕业论文 第1章 文献综述近年来，抗生素、激素、防腐剂等药物性饲料添加剂在动物饲养中的广泛应用，有力地促进了动物饲养业的发展，但是，研究发现，药物性添加剂的普遍应用给人们带来了难以克服的弊端，尤其是抗生素的使用。抗生素的经常使用产生的细菌耐药性问题和残留问题，对人类

14、健康潜在的危害更大。抗生素应用的副作用主要表现在以下几方面:(1)抗生素的滥用引起动物内源性感染或二重感染。(2)抗生素的长期使用还会使病原菌产生耐药性，这是抗生素治疗疾病越来越不理想的原因之一。(3)抗生素的长期使用可以使畜禽免疫功能下降，甚至导致动物发病或死亡。(4)药物性饲料添加剂在畜禽产品中的残留直接威胁人类健康。(5)抗生素在环境中的残留造成环境污染，也影响人类健康和安全。由于抗生素在饲料中使用带来的种种弊端，就要求人们去寻找和开发无毒、无副作用、天然的生长促进剂和能够预防和治疗疾病的产品，于是微生物生长促进剂和益生菌饲料添加剂就应运而生。1.1 动物微生态制剂概述1.1.1 动物微

15、生态制剂的概念 动物微生态制剂是根据动物微生态平衡理论、微生态失调理论、微生态营养理论和微生态防治理论， 利用动物体内正常微生物成员及其代谢产物或生长促进物， 经培养、发酵、干燥、加工等特殊加工工艺而制成的生物制剂或活菌剂1。它是用于调节动物机体微生态平衡的具有直接通过增强动物对肠内有害微生物的抑制作用或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病， 从而促进动物生长或提高饲料转化率的一类药物或饲料添加剂2， 又称为益生素、促生素、利生素、生理菌苗， 是近几年发展起来的高科技产品。微生态制剂以其无毒副作用、无耐药性、无残留、成本低、效果显著、不污染环境等特点， 逐渐得到广大养殖界同仁的首肯3。1.1.2

16、 动物微生态制剂的分类1. 乳酸菌微生态制剂乳酸菌是一类可以分解糖类产生乳酸的菌的总称。此类制剂应用最早、最广泛，种类繁多。通常厌氧或者兼性厌氧生长，缺点是不耐高温，经80 处理5 min，损失70% 80%。在颗粒饲料制备过程中损失率较大。但耐酸，在ph 值为3.04.5时仍可生长，对胃中的酸性环境有一定的耐受性。在动物体内通过生物拮抗、降低 ph 值阻止和抑制致病菌的侵入和定植，降解亚硝氨、氨、吲哚、粪臭素等有害物质，维持肠道中正常的生态平衡。活菌体内和代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶（sod），能增强动物的体液免疫和细胞免疫。也能够产生氨基酸、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等消化酶。乳酸菌在动

17、物肠道的定植具有特异性。研究发现乳酸菌在鱼体肠道系统定植，可以抵抗革兰氏阴性致病菌，增强抗感染能力，增加机体肠黏膜的免疫调节活性，促进生长。在哺乳和断乳期动物中使用能够防治腹泻，维持肠道正常生态平衡。目前主要应用的乳酸菌主要是来源于乳酸杆菌属、乳酸链球菌属和双歧杆菌属的近30种的微生物。2. 酵母菌微生态制剂饲用酵母的种类主要有热带假丝酵母、产月元假丝酵母、啤酒酵母、红色酵母等。饲用酵母对动物体的主要作用可分为以下几点：促生长特性。酵母细胞富含蛋白质、核酸、维生素和多种酶，具有提供养分、增加饲料适口性，加强消化吸收等功能，并可提高动物对磷的利用率。由于酵母丰富的营养组成，因此饲用酵母可以部分或

18、者全部替代饲料中的鱼粉。研究发现，磷在鱼体中的吸收率高达93%，是除某些磷酸盐以外的常规饲料中吸收率最高的；改善肠道微生态环境。酵母菌是肠道有益微生物，研究发现饲料中添加酵母可促进瘤胃微生物的生长和活性，使厌氧菌总数上升、纤维素发酵菌数量明显上升；促进动物体免疫功能，增强抗病力。酵母细胞壁的主要成分是甘露聚糖、葡聚糖，研究发现甘露聚糖可增强吞噬细胞的活性。在火鸡日粮中添加甘露聚糖可使血清中igg和肝脏中iga 浓度提高25 %；可直接和肠道病原体结合，中和肠道中毒素。酵母中的甘露聚糖可以和肠道病原菌的纤毛结合，阻止病原菌在肠道粘膜中的定植。试验还发现甘露聚糖可以降低畜禽动物粪便中沙门氏菌、大肠

19、杆菌的含量。3. 芽孢杆菌微生态制剂芽孢杆菌是一类好氧菌，在一定条件下产生芽孢，和常用的乳酸菌等益生菌相比，芽孢杆菌具有以下优点和特点：具有耐高温、耐酸碱、耐压等特点，能够耐受颗粒饲料加工的影响；在贮藏过程以孢子形式存在，不消耗饲料的营养成分，可以保持饲料的质量；进入肠道后，在肠道上部迅速复活，复活率接近100 %；芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸；芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡；具有平衡和稳定乳酸杆菌的作用。目前使用的菌株有枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（bacillus licheni

20、formis）、蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、东洋芽孢杆菌（bacillus toyoi）等。4. 光合细菌微生态制剂光合细菌是能够进行光合作用的一类微生物。能够在厌氧光照条件下利用光能同化co2，有些菌还能够进行固氮作用。经分析，光合细菌的细胞成分优于酵母菌和其它种类的微生物，菌体蛋白中多种必需氨基酸的含量高于酵母菌。光合细菌不仅为生物体宿主提供丰富的蛋白质、维生素、矿物质、核酸等营养物质，而且可以产生辅酶q 等生物活性物质，提高宿主的免疫力。光合细菌还在改善水体环境、增加水产动物体重、色泽等方面有很好的效果。小林达治（1976年）使用以光合细菌为主的活菌投喂鲤鱼，2周后比

21、对照组体长增长2倍多。5. 其它饲用微生物研究发现在反刍动物的饲料中使用真菌类微生物效果较好，可以使瘤胃中细菌总数量增加和产纤维素酶的量增加。用到的主要是曲霉属的烟曲霉、米曲霉等几种菌。在水产养殖中添加的微生物主要有乳酸菌、弧菌、假单胞菌、藻类等。国外研究发现一些弧菌、藻类、假单胞菌能够抑制病原菌的生长，提高水产动物的成活率，可用作水产动物促生长剂和免疫调节剂。但是目前国内在这方面的研究应用很少，开发在水产养殖上使用的微生物具有很好的应用前景，应加紧在这一领域的研究工作。1.2 芽孢杆菌类微生态制剂概述芽孢杆菌类微生态制剂是利用正常微生物群成员或环境中的有益芽孢杆菌，通过鉴定、筛选、培养、干燥

22、等系列工艺制成的一种新型活菌制剂。具有防治疾病，促进生长等功效，且无毒，无残留。芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活，复活率接近100 %，并分泌活性很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多败类物质，同时通过生物夺氧消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，肠道原籍优势菌大多属厌氧菌，而有害菌和外来菌多为需氧菌，从而有利于维持肠道生态平衡。此外，芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱、耐挤压，饲料加工对其损失小等特性。因此在饲料工业上得到广泛应用。1.2.1 饲用芽孢杆菌的特点芽孢杆菌菌种是微生物饲料添加剂产品质量和应

23、用效果的关键，因此长期以来，各国都在寻求自己的菌源。作为微生物饲料添加剂，其应具备以下几个条件: (1) 所选用的微生物，通常是来源于家畜体内的有益微生物。因为来源于家畜体内的微生物经人工培养、繁殖，制成添加剂后，很容易在家畜体内定植、繁殖。(2) 所选用的微生物，繁殖率要高，这样才能迅速占据消化道，以抑制其病原微生物的侵入和定植。(3) 所选用的微生物，还应具有较强的产酸能力，这样利于消化道对营养物质的消化吸收，提高饲料的转化率。(4) 所选用的微生物应具有较强的生命力及耐受性，在生产添加剂的过程中，不致于失去活性而丧失功效。(5) 所选用的微生物应是非病原性的，因此必须确定出菌株的安全性，

24、并且对该菌种可能的代谢产物进行系统研究。到1989 年，美国食品药物管理局和美国饲料协会不定期发表可以用在畜禽生产中的芽孢杆菌菌种。1.2.2 饲用芽孢杆菌的生理功能1. 调节动物肠道菌群平衡 维持厌氧环境，竞争排斥致病性微生物 nurmi 和rantala4 最早提出竞争排斥法则，即在刚孵出的雏鸡中口服厌氧菌培养物，使小鸡肠道维持厌氧环境，尽早建立起正常的微生物菌群，使其有序定植于黏膜皮肤等的表面或细胞间形成的生物膜样结构上，构成机体的防御屏障，或和病原菌竞争营养物质和黏附受体5 6 ，竞争排斥好氧致病性微生物，从而影响过路菌或致病菌的定植、占位、生长和繁殖。好氧的芽孢杆菌等进入动物胃肠道后

25、生长繁殖，消耗肠道内的氧气，使局部环境的氧分子浓度降低，造成厌氧环境，利于厌氧菌等有益微生物的定植和生长，排斥好氧病原菌的繁殖，维持胃肠道菌群的平衡。王晓霞等 7 研究表明在肉鸡日粮中添加0.1 %枯草芽孢杆菌，能选择性增加肉鸡盲肠中的乳酸杆菌等有益菌群的数量，减少大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌的数量。苏勇等8 也证明: 仔猪断奶前，空肠和结肠食糜中乳酸菌和大肠杆菌的数量较稳定，断奶后仔猪空肠和结肠食糜中乳酸菌和大肠杆菌的数量均明显下降，与对照组相比芽孢乳杆菌s1 能提高断奶后仔猪空肠和结肠食糜中乳酸杆菌与大肠杆菌的数量。另有研究表明9 ，钠豆芽孢杆菌能使肠道厌氧菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌、梭菌和

26、拟杆菌数均有不同程度增多，肠杆菌、肠球菌等需氧菌群数量则明显减少，能有效调整大白鼠肠道菌群数量的变化，起到维持肠道微生物平衡的作用。 产生代谢物杀灭致病性微生物 芽孢杆菌在肠道中生长繁殖的同时会产生一些生理活性代谢产物如细菌素、有机酸、过氧化氢等，能抑制和杀死肠道病原菌，从而调节和维持动物消化道微生物区系的平衡。淳泽10 的研究表明，芽孢杆菌对猪大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌都有拮抗作用，芽孢杆菌能产生脂肪酸，但产量极微，不足以抑制致病菌的生长。芽孢杆菌培养物滤液经硫酸沉淀，柱层析分离纯化，初步证明拮抗作用是由于产生蛋白质类拮抗物质。h1 sugita 等11 报道从斑鳍

27、衔肠道分离出的芽孢杆菌能产生一种抑制嗜盐弧菌的抗菌素，显著抑制鱼体肠道嗜盐弧菌的生长繁殖。2. 增强动物营养代谢功能 芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖的同时，还能产生多种营养物质，如维生素、氨基酸、促生长因子等促进动物机体的物质代谢。savage12 估计在动物盲肠中的微生物可为动物提供维生素需要量的25 %30 %。凝结芽孢杆菌、芽孢乳杆菌等菌株能产生乳酸，可提高动物对钙、磷、铁的利用，促进维生素d 的吸收，同时芽孢杆菌还可以有效增殖肠道内的双歧杆菌和乳酸杆菌等产酸菌，改善胃肠道环境，促进钙、磷、铁等微量元素的利用和维生素d 的吸收，另外增殖的双歧杆菌和乳酸杆菌等产酸菌还能自身合成或促进合成多种

28、b 族维生素13 ;双歧杆菌还能通过抑制某些维生素分解菌来保障维生素的供应，如它能抑制分解维生素bl的解硫胺素芽孢杆菌的生长，调节维生素bl 的供应，从而增强动物体内的营养代谢功能。3. 增强动物免疫功能 芽孢杆菌是一种很好的免疫增强剂，能促进肉鸡免疫器官的生长发育，提高机体体液、细胞免疫功能和抗病能力，同时芽孢杆菌的表面抗原或它们的代谢产物通过刺激粒细胞的吞噬活动来充当免疫源在提高机体的抗病力方面具有很好的免疫学基础14 15 。rengpipat 等16 研究发现芽孢杆菌s11 能有效激活和增强虾淋巴吞噬细胞、酚氧化酶、抗菌物活性和吞噬细胞指数( pi) ，且pi 值从( 0.6 0.3)

29、 增加到( 2.7 0.8) 。inooka等17 试验表明在来航母仔鸡饲料中添加106 cfu/g或107 cfu/ g 的纳豆芽孢杆菌15 d 或30 d 后，均能够增强雏鸡对抗绵羊红细胞的凝集抗体产生，提高雏鸡免疫应答反应。inooka18 在白来航仔公鸡基础日粮中添加107 cfu/ g 纳豆芽孢杆菌，试验期为27 d ，结果发现添加纳豆芽孢杆菌组与对照组相比，可显著提高脾脏中t、b 淋巴细胞百分率，表明纳豆芽孢杆菌可以显著提高细胞免疫水平。张富等19 用芽孢杆菌饲喂雏鸡后，发现芽孢杆菌对免疫器官增重在第2 周龄和第6 周龄不显著，其余周龄都表现显著或极显著。表明芽孢杆菌能促进免疫器官

30、的生长发育。卢胜明20 报道，添加芽孢杆菌的试验组其新城疫血凝抑制效价极明显高于对照组，脾脏指数、胸腺指数均显著高于对照组。周国勤等21 还证明纳豆芽孢杆菌及其发酵产物可明显提高鱼类的非特异性兔疫功能。4. 产生多种酶类，提高消化酶活性 芽孢杆菌在生长繁殖的同时会产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪分解酶等活性消化酶，能有效裂解大量碳水化合物、脂肪、蛋白质成小的单位，帮助动物对营养物质的消化吸收，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌除具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性外，同时还具有降解植物饲料中某些复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，其中很多酶是哺乳动物和禽类不具有的酶2223 。wang yan

31、bo 等24 用0.1 %的光合细菌、0.1 %芽孢杆菌和0.1 %的光合细菌+0.1 %芽孢杆菌添加到鲤鱼的基础饲粮中，经过60 d的饲养试验，与对照组相比，试验组的消化酶活性均高于对照组，芽孢杆菌组和复合组蛋白酶活性极明显高于对照组，复合组的脂肪酶和淀粉酶活性极显著。邝哲师等25 研究表明:试验组在基础日粮中添加0.1 %的芽孢杆菌制剂饲养14 d后试验组比对照组胃蛋白酶活性提高58.68 %，胰淀粉酶活性提高24.05 % ，回肠内蛋白酶和淀粉酶活性分别提高6.10 %和20.30 % ，差异显著。陈兵也证明26 ，纳豆芽孢杆菌剂能提高十二指肠消化酶(总蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶) 的活力5

32、2.2 % 89.2 %，纳豆芽孢杆菌剂的最佳添加量为200 mg/ kg。saeed ziaei nejad等27 也有相似的报道。5. 改善动物体内外生态环境，降低粪便中氨和硫化氢等有害物质含量 饲喂芽孢杆菌可抑制肠道内腐败菌生长，减少腐败物质产生，降低粪便中氨和硫化氢含量。wheeler 报道，在猪日粮中添加芽孢杆菌后，肠道内可产生氨基氧化酶及分解硫化氢的酶类，减少蛋白质的无效降解，降低血液和肠道中氨的浓度，且粪便中大肠杆菌数减少到原来的2 % ，减少向外界排泄量，改善生态环境。scheuermann28 用蜡样芽孢杆菌饲喂猪，发现血氨浓度降低13.5 %20.1 % ，尿氨浓度降低5.

33、5 % 17. 0 %。王晓霞等7 用果寡糖+ 枯草芽孢杆菌的添加使发酵粪中nh3 和h2s 的散发量分别降低62.14 % 和28.49 %。mongkol 等29 研究表明在肉仔鸡饲料中添加0.5 %的纳豆枯草芽孢杆菌28 d 后，其血氨浓度显著降低。6. 促进动物肠道发育 mongkol 等29 研究表明添加0.12 %或0.15 %的纳豆枯草芽孢杆菌组与对照组相比，能显著提高肉鸡的生产性能，另外鸡小肠黏膜皱裂增多，绒毛长度增加，黏膜隐窝加深，小肠吸收面积增大，差异显著。7. 提高动物生产性能 芽孢杆菌能显著提高生产性能:提高动物的日增重，饲料转化率，降低料肉比等。wang yanbo

34、等24 用0.1 %的光合细菌、0.1 %芽孢杆菌和0.1 %的光合细菌+ 0.1 %芽孢杆菌添加到鲤鱼的基础饲粮中，经过60 d 的饲养试验，试验组的生产性能明显高于对照组。saeed ziaei nejad 等27 报道添加芽孢杆菌的试验组的饲料转化率、比生长速率、成活率和湿重均显著高于对照组。陈兵等30 在仔猪日粮中添加纳豆芽孢杆菌，结果表明:前期试验组仔猪日增重分别较对照组提高12.31 %和12.51 % ，料重比下降8.56 %和6.131 %;后期试验组仔猪日增重比对照组分别提高11.36 %和9.14 % ，料重比下降8.70 %和5.93 % ，尤以低剂量添加组效果较好。潘康

35、成31 报道添加0.1 %的枯草芽孢杆菌制剂的试验组35 d 后，试验组肉鸡的末期平均体重、净增重和日增重均高于空白对照组，试验组的饲料转化率较空白对照组提高3.14 %。kyriakis 等32 在仔猪饲料中添加106 cfu/ g 或107cfu/ g 鲜样芽孢杆菌，平均日增重和饲料转化率显著优于对照组。且添加量为107 cfu/ g 试验组，能很好控制仔猪断奶后腹泻综合症。陈兵等26 又证明纳豆芽孢杆菌剂能提高鸡生产性能，当添加量为200 mg/ kg 时，平均日增重(adg) 和平均日采食量(adfi) 达到最大，分别比对照提高2.47 g 和5.11 g。1.2.3 饲用芽孢杆菌有待

36、研究的问题饲用芽孢杆菌用作畜禽的微生物制剂，已广泛得到应用和推广，对我国的绿色畜牧事业作出重大贡献。因此应对以下问题进行更广泛深入研究，以进一步加快饲用芽孢杆菌在生产中的应用步伐: (1)目前使用的芽孢杆菌能否在体内增殖，在何处增殖，增殖速度如何，这是芽孢杆菌在动物体内发挥作用的基础，但这方面的研究却展开较少，尚属于空白。(2) 加强菌种研究，筛选出繁殖力强、性能稳定、协同作用强和安全无副作用的菌种供生产应用。(3) 芽孢杆菌制剂的加工工艺会影响最终产品的芽孢数量，应加强研究提高活菌浓度，提高菌剂中活菌对不良环境的耐受力，延长产品保存期的方法。(4) 动物的生存环境会影响芽孢杆菌的添加效果，在

37、环境条件比较差的情况下，芽孢杆菌的使用效果较好，随着动物日龄不断增长，其作用往往体现不出来，因此应加强对芽孢杆菌作用机理的深入研究，以更好指导生产。(5) 饲用芽孢杆菌在畜禽生产中应用时，都强调以活的形式添加，但制剂中含有大量的死菌和代谢产物，它们与活菌相比，对动物机体的影响报道很少。由于动物的种类、年龄、菌种组合及活菌含量、动物环境、饲喂条件、饲料加工贮存方法等因素的影响，以不同的作用效果如生产性能、免疫功能、肠道菌群变化作为考察指标时，饲用芽孢杆菌的最适添加量仍有待进一步研究。(6) 加强芽孢杆菌与肠道菌群的互作效应和提高其在动物肠道内的萌发效率的研究。(7) 加强芽孢杆菌与其他益生素及酸

38、化剂、低聚糖、酶制剂等绿色饲料添加剂之间组合使用技术以及对不同动物不同生理阶段的适宜添加量的研究。(8) 加强研究和制定芽孢杆菌产品生产质量、检验等标准，保证产品的质量和指导产品的开发。1.3 微生态制剂的研究前景 1.市场对高效、无残留、无公害的微生物饲料添加剂的显在需求和潜在需求正在加速增长。政府、生产商和食品消费者对食品安全和健康有了更多了解和关注。 2.由于了解到高质量的微生物饲料添加剂的益处和明确功效，使用者正在快速增长。可以将目前的市场状况看作是市场启动的初期，将迎来快速成长期。 3.微生物饲料添加剂是替代抗生素和合成抗菌药物作为饲料添加剂的最有效、最可行的方案之一。随着国家立法及

39、监督力度的加大(以2000年“饲料安全工程”启动为标志，已开始)，药物添加剂的使用将呈下降趋势，微生物饲料添加剂的潜在市场随之扩大。 4.中国将随着欧盟和北美逐年限制药物添加剂，直至完全禁用药物作为饲料添加剂。中国加入wto后，将加快这个进程，否则中国畜禽产品无法出口。这样，微生物饲料添加剂将作为保健促生长用饲料添加剂市场的最主要的部分，潜在市场扩大许多倍。 5.随着大型厂商的进入和国外产品的竞争，国内大多数小型厂商将很快被挤出微生物饲料添加剂市场，有的会转而生产低价值的发酵生物饲料供应本地小区域市场。未来中国的微生物饲料添加剂市场，将由很少的中国公司和数家外国公司分享。因此筛选出用于微生态制

40、剂优良的芽孢杆菌并进行鉴定、确立抗病促生机理、实现液体发酵的最佳发酵条件、并以粗酶制剂为吸附载体，配合寡糖、矿质盐及其他生长素类物质，研制出复合微生态制剂产品。为实现其产品的产业化，推动饲料添加剂产品向高效、无公害的方向发展，实现畜产品的绿色化具有重要的理论价值和实践指导意义。1.4 本课题的意义芽孢杆菌类微生态制剂是利用正常微生物群成员或环境中的有益芽孢杆菌，通过鉴定、筛选、培养、干燥等系列工艺制成的一种新型活菌制剂。具有防治疾病，促进生长等功效，且无毒，无残留。芽孢杆菌是一类好氧生长，可形成芽孢的革兰氏阳性菌，是国家允许使用的饲料微生物菌种。芽孢杆菌在制剂中以芽孢形式存在，芽孢进入动物肠道

41、后，在肠道上部能迅速复活，复活率接近100%，并分泌活性很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多败类物质，同时通过生物夺氧消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，肠道原籍优势菌大多属厌氧菌，而有害菌和外来菌多为需氧菌，从而有利于维持肠道生态平衡。此外，芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱、耐挤压，饲料加工对其损失小等特性。因此对芽孢杆菌受到众多研究者的青睐，但目前研究者主要把研究的重点放在枯草芽孢杆菌的生物学功能及其作用机制上，而对以芽孢为最终产物的发酵工艺的研究较少。枯草芽孢杆菌可以产生内生芽孢，抗逆性强，在土壤和植物表面普遍存在，其芽孢可以制成粉剂添

42、加到饲料中应用于畜牧业生产。制剂中的芽孢含量是影响制剂应用效果的关键因素，本研究的目的是通过优化发酵培养基配方及其发酵条件，提高发酵液中菌体含量，再通过后处理提高芽孢形成率，为大规模工业化生产奠定基础，有助于降低生产成本，提高制剂的生防效果。1.5 试验内容简介 本课题的主要研究内容包括: 研究不同c、n源和无机盐离子对枯草芽孢杆菌生长的影响；通过正交试验设计确定最佳的培养基组成；用50 l发酵罐对枯草芽孢杆菌的中试研究，以验证最佳培养基的可行性；发酵后处理促进枯草芽孢杆菌芽孢形成;第2章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 供试菌种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。2.1

43、.2 培养基1. 斜面培养基：葡萄糖20 g/l、蛋白胨15 g/l、nacl 5 g/l、kh2po4 2 g/l、k2hpo43h2o 4 g/l、琼脂20 g/l，ph 7.0，121 灭菌20 min。2. 摇瓶种子培养基：葡萄糖20 g/l、蛋白胨15 g/l、nacl 5 g/l、kh2po4 2 g/l、k2hpo43h2o 4 g/l，ph 7.0，每个250 ml三角瓶装培养基100 ml，121 灭菌20 min。3. 优化斜面培养基：葡萄糖10 g/l、蛋白胨7 g/l、nacl 5 g/l、kh2po4 2 g/l、k2hpo43h2o 4 g/l、琼脂20 g/l，p

44、h 7.0，121 灭菌20 min。4. 基础发酵培养基：葡萄糖10 g/l、蛋白胨7 g/l、nacl 5 g/l、kh2po4 2 g/l、k2hpo43h2o 4 g/l，ph 7.0，每个250 ml三角瓶装培养基100 ml，121 灭菌20 min。5. 正交优化培养基：葡萄糖15 g/l、蛋白胨4 g/l、nacl 5 g/l、kh2po4 2 g/l、k2hpo43h2o 4 g/l、mnso4 0.4 g/l、mgso4 7h2o 2 g/l，ph 7.0，121 灭菌20 min。2.1.3 主要药品与试剂葡萄糖(ar)，天津市科密欧化学试剂有限公司；蔗糖(ar)，北京科

45、龙化工试剂厂；可溶性淀粉(ar)，北京科龙化工试剂厂；蛋白胨（503型），生物试剂，成都长寿生物试剂有限公司；酵母膏，生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂，福建省石狮市琼脂副食品加工厂；k2hpo43h2o、kh2po4、li2so4、na2co3、mnso4、naoh、h2so4、nacl、cuso45h2o、nawo22h2o 、mgso47h2o、na2moo22h2o 、磷酸、浓盐酸、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠均为国产分析纯试剂。2.1.4 主要仪器设备 50 l 实验室用高级发酵罐，上海宝兴生物工程设备有限公司hzq-f型全温振荡培养箱，哈尔滨市东联

46、电子技术开发有限公司；722型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂；tgl-16g型台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；yb电子天平，上海海康电子仪器厂；ldzx40型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；ws70-1型红外线快速干燥器，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；dl-1型电子万用炉，北京市永光明医疗仪器厂；双人双面超净工作台，苏净集团安泰公司；dhp-9162型电热恒温培养箱；bcd-219hc冰箱，中国雪柜实业有限公司；dhg-9245a型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；bs2202s型电子称；ld5-2a型低速离心机，北京医用离心机厂；ch20型光学显微镜；2.1.

47、5 相关溶液配置1. dns溶液 称取3，5-二硝基水杨酸（dns） 6.3 g于500 ml大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入262 ml 2 mol/l的naoh溶液，加到酒石酸钾钠溶液中（192 g酒石酸钾钠溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后定容至1000 ml，保存于棕色瓶中，放置7-10天即可使用。2. folin-phenol(福林酚)试剂 试剂a：1 g无水na2co3溶于50 ml，0.1 mol/l的naoh中，另将0.5 g cuso45h2o溶于100 ml1%的酒石酸钾钠溶液中。将前后两种溶液按50:1的比例混合即为a试剂，此

48、试剂只在一天内有效。 试剂b：将100 g钨酸钠（nawo22h2o）、25 g钼酸钠（namoo22h2o）、700 ml蒸馏水、50 ml 85%磷酸及100 ml浓盐酸装入带回流装置的2000 ml的圆底烧瓶中，充分混合，文火缓慢回流10 h；再加入150 g硫酸锂（li2so4）、50 ml蒸馏水及几滴溴液，然后将瓶内溶液开口煮沸15 min，以驱除过量的溴；冷却至室温，定容至1000 ml，过滤，滤液呈微绿色。吸取10 ml 1 mol/l的naoh溶液，放入100 ml的锥形瓶内，加入两滴酚酞指示剂，用上述滤液滴定。当溶液的颜色从微绿经紫灰，到突然转为墨绿色时即为滴定终点。根据滴定

49、所用的滤液量计算其酸度（相当于2 mol/l hcl溶液），向滤液中加入约1倍的蒸馏水，使滤液最终酸度为1 n。此液即为folin-酚试剂b。将其置于棕色试剂瓶内，放入冰箱中可长期保存。3. 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 母液a： 0.2 mol/l的磷酸氢二钠溶液：称取28.40 g na2hpo4溶解，定容到1 l，即为0.2 mol/l的磷酸氢二钠溶液。（na2hpo4分子量 = 149.8） 母液b: 0.1 mol/l的柠檬酸溶液：称取21.01 g c4h2o6h2o溶解，定容到1l，即为0.1 mol/l的柠檬酸溶液。(c4h2o6h2o分子量 = 210.14) 取母液a 7.71

50、ml与母液b 12.29 ml混合，即为ph 4.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液。 取母液a 15.45 ml与母液b 4.55 ml混合，即为ph 6.8的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液。4. 1 g/l葡萄糖标准溶液 用万分之一分析天平准确称取葡萄糖（分析纯）1 g，加少量蒸馏水溶解，定容至1000ml。5. 1 mg/ml牛血清蛋白标准溶液 用万分之一分析天平准确称取牛血清蛋白（分析纯）0.1 g，加少量蒸馏水溶解，定容至100 ml。 6. 土壤浸出液 称取200 g取自学校东校门处柳树根部的20-30 cm深处的土壤，溶于1000 ml蒸馏水中，搅拌均匀，加热煮沸20 min，反复过滤，取上清液

51、，密封后121 灭菌20 min，保存备用。2.2 实验方法2.2.1 标准曲线的绘制1. 葡萄糖标准曲线的绘制 （1）取6只试管，标号为0，1，2，3，4，5，分别吸取0，0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 ml 1 g/l的葡萄糖标准液顺序加入到6只试管中，再向各试管中顺序加入2.0，1.8，1.6，1.4，1.2，1.0 ml蒸馏水使各试管中的液体体积为2 ml，再向各试管中分别加入1.5 ml dns试剂。然后置于沸水浴中沸腾，计时5 min，取出后用流水冷却到室温后，分别加入21.5 ml纯水，摇匀。 （2）以0号管作为对照，用分光光度计在540 nm下测定各管液体的吸光值a5

52、40，并绘制出标准曲线。表2-1为葡萄糖标准曲线的制定方法步骤。 表2-1 葡萄糖标准曲线测定 管号012345葡萄糖标准液(1 mg/ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.0dns试剂/ml1.5沸水浴5 min冷却流水冷却蒸馏水/ml21.5a54000.0720.1950.3170.4610.5802. 蛋白质标准曲线的绘制 （1）取6只试管，标号为0，1，2，3，4，5，分别吸取0，0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 ml 1 mg/ml的牛血清标准液顺序加入到6只试管中，再向各试管中顺序加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0

53、 ml蒸馏水使各试管中的液体体积为1 ml，再向各试管中分别加入5 ml folin-phenol试剂a，混匀，25 静置10 min，再向各试管中加入0.5 ml folin-phenol试剂b，混匀，25 静置30 min。 （2）以0号管作为对照，用分光光度计在500 nm下测定各管液体的吸光值a500，并绘制出标准曲线。表2-2为牛血清蛋白标准曲线制定的具体步骤。 表2-2 牛血清蛋白标准曲线测定 管号012345牛血清蛋白标准液 (1 mg/ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20folin-phenol试剂a /ml5 混匀，25 静置10

54、 minfolin-phenol试剂b /ml0.5 混匀，25 静置30 mina50000.1410.2920.4360.5970.7462.2.2 菌种的活化 1. 将保藏枯草芽孢杆菌菌种转接到斜面培养基中，在37 的恒温培养箱中培养24 h，备用。2. 取一环活化的菌种，接入装液量为100 ml的摇瓶种子培养基的250 ml的三角瓶中，37 ，160 r/min培养24 h。2.2.3 c源消耗量和n源消耗量计算方法 用dns法测定发酵前后发酵液中的葡萄糖含量mc前和mc后，计算出发酵过程所消耗的葡萄糖量：mc=mc前mc后用folin-pheno法测定发酵前后发酵液中的蛋白质含量mn

55、前和mn后，计算出发酵过程所消耗的葡萄糖量：mn=mn前mn后2.2.4 摇瓶培养分别取10 ml种子液，接入盛有100 ml基础发酵培养基的250 ml的三角瓶中（接种量10%，v/v）。置摇床中，37 ，160 r/min培养24 h，进行单因素和正交试验的发酵条件研究。2.2.5 培养基优化单因素试验1. c源单因素试验分别用10 g/l的葡萄糖、淀粉、蔗糖等量代替基础发酵培养基中的葡萄糖制成培养基。置摇床中，37 ，160 r/min培养24 h，测定发酵液中的活菌含量，以确定最佳c源。2. n源单因素试验分别用7 g/l的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨替代基础发酵培养基中的蛋白胨制成培养基。置摇床中，37 ，160 r/min培养24 h，测定发酵液中的活菌含量，以确定最佳n源。3. 无机盐试验向原发酵培养基中加入2 g/l的mgso47h2o，其他成分不变，制成培养基；向原发酵培养基中加入0.6 g/l的mnso4，其他成分不变，制成培养基；用土壤浸出液代替在配置培养基时使用的蒸馏水，其他成分不变，制成培养基，以原基础培养基作为对照。置摇床中，37 ，160 r/min培养24 h，测定发酵液中的活菌含量，以确定最佳无机盐。2.2.6 正交试验优化培养基成分将筛选出的最有的c源、n源和无机盐3个重要因素进行4