MicroRNA培训教材

1、、microRNA 简介 1 .什么是 microRNA microRNAs (microRNAs )是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功 能的非编码RNA，其大小长约1923个核苷酸。成熟的microRNAs是由较长 的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的 沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同 指导沉默复合体降解靶 mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻译。最近的研究表明 microRNA参与各种各样的调节途径，包括生物个体发育、病毒防御、组织分化、 细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、参与原癌基因作用等等。 2. MicroRNA 的

2、发现 1993年，Lee, Feinbaum 和 Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA (lin-4)，是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本 能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。 对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3UTR 区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。在第一幼虫阶段的末 期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。7年后科学家又发现了 第二个microRNA let-7， let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。 自从let-7发现

3、以来，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在 众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了上千个的microRNAs。被鉴定 的microRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。此网站由著名的Sanger研 究所主办，并对公众开放。(/ ) 3. microRNA的产生与作用机制 microRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，约 60%microRNA 单独表达，15%的microRNA 基因簇的形式表达，而 25%的 microRNA位于基因的内含子中，与基因同时被转录。 microRNA通常来源于一个大小约1

4、000bp的长链 RNA初始转录产物 (Pri-microRNA ) , Pri-microRNA 分子在细胞核中经过双链RNA 特记性 RNaseHI-Drosha 的作用形成70-100nt的具有茎环结构的RNA 分子 (Pre-microRNA)。Pre-microRNA 在exportin-5的作用下转运至细胞质中，被 另一个双链RNA特异性RNaseIII-Dicer识别，被进一步切割成 19-23nt的小分 子 RNA，即成熟的 microRNA，microRNA 再被 PPD( PAZ microRNA的正调控和去抑制等等，具体机理还有待我们科研工作者进一步研究 和探讨。 4.

5、MicroRNA 与 siRNA 的异同 siRNA是RNAi途径的主要作用物，microRNA和siRNA很容易混淆，他们有 许多共同点也有许多不同点 microRNA 和 siRNA 都是由 22 个左右的核苷酸组成，都依赖 Dicer 酶的加工， 是 Dicer 的产物，所以具有 Dicer 产物的特点。二者生成都需要 Argonaute 家族 蛋白存在，而且都是 RISC 组分，所以其功能界限变得不清晰，如在介导沉默机 制上有重叠。另外，它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译。 microRNA 和 siRNA 本质上的区别就是 microRNA 是内源的，在基因组中有固

6、 定的基因座位，70%90%位于蛋白基因的基因间隔区，其余在内含子，还有 个别在编码区的互补链； siRNA 可以是人工体外合成的， 也可以是基因组的转录 片断，降解片断，和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于 siRNA 没有 固定的基因座位， 本身不是基因组的功能片断， 是随机产生的， 即加工位点不是 保守的。结构上，microRNA 是单链RNA，而siRNA是双链 RNA。3.Dicer酶 对二者的加工过程不同， microRNA 是不对称加工， microRNA 仅是剪切 pre-microRNA 的一个侧臂，其他部分降解；而 siRNA 对称地来源于双链 RNA 的前体的两侧臂

7、。在作用位置与作用方式上， microRNA 主要作用于靶标基因 3-UTR区，可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平 后和翻译水平起作用， 主要在发育过程中起作用， 调节内源基因表达。 而 siRNA 可作用于 mRNA 的任何部位，但 siRNA 只能导致靶标基因的降解，即为转录水 平后调控，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。 二、microRNA的研究思路与方法 对 microRNA 的深入研究具有重大的生物学意义， 不仅有利于我们对生物体生 理、病理机制的理解，还能为疾病的诊断和治疗中提供理论依据。 已有研究表明 ,microRNA 在发育、 细胞增殖、凋亡、脂类

8、代谢、激素分泌及肿 瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用。 针对 microRNA 的研究方法主要 包括两大类 :一是以传统实验技术方法为基础建立起来的microRNA 特有的技术 方法 ,二是已成熟应用的生物信息学技术。前者侧重于microRNA 表达的检测和 功能机制的阐明 ,后者则包括新 microRNA 基因及 microRNA 靶基因的预测。两 者相辅相成 ,互为补充 ,为深入地研究这类分子的功能和分子机制提供了大量功能 线索及确凿的实验证据。 由于microRNA序列短、没有poly(A)尾巴、在细胞内的表达水平比较低，而且 许多同源microRNA (如let-7家族)序列相

9、似度高，仅差1-2个碱基，使设计的分 析探针与杂交的效率低。这些特性给microRNA定量检测方法的建立带来了困难 和挑战。 为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏度， 丹麦Exiqon公司的锁核酸(Locked Nucleic Acid ， LNA)技术被应用于microRNA的分析研究。LNA是一种双环结 构的核酸类似物，这种特殊的双环状核苷酸衍生物结构中含有一个或多个2-0, 4-C-亚甲基-俟D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2-0位和4-C位通过不同的缩水作 用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定 了呋喃糖C3-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐

10、骨架局部 结构的稳定性，实验表明，在寡核苷酸探针中每引入 1个LNA修饰碱基，其与相 应的DNA杂交时，解链温度会提高1-8 C，而在与RNA杂交时解链温度会提高 2-10 C,从而提高LNA探针与microRNA分子的杂交特异性和灵敏度。 由于LNA与RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对 RNA有很好的识 别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点：和RNA 互补的双链有很强的热稳定性、实现探针高灵敏度；水溶性好，自由穿入细胞膜， 易被机体吸收；体内无毒性作用；高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单， 部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪

11、上合成。 LNA探针与核酸杂交具有严格序列特异性，能有效区分碱基错配从而实现高特 异性。 目前，基于锁核酸(LNA)等技术的支撑，科学家研究出了多种有效的 microRNA 检测方法，如 Northernblotting、微阵列法(microRNAarray)、克隆 和测序法、实时荧光定量PCR法等。 LNADNARNA 1. Northern 印迹 从 microRNA 的发现到现在 microRNA 的研究， Northern 印迹技术一直被应 用 microRNA 的鉴定和新 microRNA 的发现。该方法一般是先用聚丙烯酰胺电 泳(PAGE )分离出总RNA中长度约200bp以内的小

12、RNA ,然后转移至印迹膜 上与标记的寡核苷酸探针进行杂交。 探针杂交，经洗膜、显影后对条带进行分析， 标记探针有放射性同位素标记和生物素或地高辛等非同位素标记。 虽然 Northern 印迹是当前 microRNA 分析的标准方法，但其缺点是操作繁琐、 耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对 RNase 污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。 锁核酸(LNA)修饰的杂交探针取代传统 DNA探针的技术，使Northernblotting 法的检测灵敏度和特异性得到显著改善。LNA (寡核苷酸衍生物)具有高亲和性， 可掺入到 DNA 中的任何位置 ,含有 L

13、NA 的探针与靶分子结合后的双链热稳定性 提高，方法灵敏度比普通 Northern 印迹法高 10 倍，特异性也明显提高。 2. 表达谱 由于 microRNAs 在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖和凋亡以及近 来被证明与肿瘤发生相关等领域发挥作用，因此 microRNAs 的鉴定和定性研究 成为迅速发展的一大研究领域。最典型的鉴定microRNAs 的方法是检测 microRNA 的表达谱，如果发现某一种 microRNA 在某种特定组织或细胞中特异 性表达的话，此 microRNA 将被假定在此特定组织或细胞中发挥某种调控作用。 同样，如果某一种 microRNA 在生物特殊发育阶段

14、表达的话， 则它有可能是调控 发育进程一个主要分子。 微阵列芯片技术 (Microarray) microRNA 的表达谱可以通过克隆特定组织、 细胞或者某个生物体特定发育阶 段的 microRNA 并测序完成，或者通过芯片检测得以完成。微阵列芯片技术 (Microarray) 是一种高通量的检测方法，能够同时测定多个样本,可以实现 microRNA 的高通量分析 ,即在一块芯片上同时固定多个与 microRNA 序列互补 的探针，然后加入经过标记的样本RNA,杂交后进行信号检测。目前，用的最广泛 的是基于 LNA 技术的芯片技术， LNA 探针与普通 DNA 捕获探针相比，可提升 熔解温度，

15、自由设计Tm值，使得芯片上的所有探针Tm值均一化，所有microRNA 杂交温度一致，保证对所有靶点具有相同的亲和活性。杂交温度高（ 60度）避 免非特异结合，标记无序列偏向性，效率高，无需富集 microRNA，因而在灵敏 度方面，LNA芯片可以检测常规DNA探针无法检测到的极其微量的 microRNA。 至今，很多研究应用该技术建立了不同物种不同组织中microRNA的表达谱， 亦有研究比较了正常组织和和疾病组织中microRNA表达谱的差异。Liu等用芯 片技术检测了 microRNA 在不同肿瘤细胞中的表达谱，均经Northern杂交、 qPCR证实。Cal in等用该技术比较了哺乳动

16、物中 B细胞淋巴瘤和正常组织中 microRNA的表达谱，为 microRNA在肿瘤临床诊治中的应用提出了新思路。 Murakami等用该技术比较肝癌组织和邻近非肿瘤组织microRNAs表达谱，发 现miR 18和miR 224在肝癌组织中的表达明显上调，而miR 199a、 miR 195a、miR 200a和miR 125a在肝癌组织中的表达明显下降。在芯片 的基础上，目前已能在特定的细胞中同时检测所有 microRNA的表达谱，并且能 够检测出福尔马林固定、石蜡包埋组织中的microRNA表达谱，使分析保存标本 中的microRNA表达谱成为可能。这也使得 microRNA表达谱特征库

17、建立成为 可能。某些特定的microRNAs表达差异已经被证明可以用于精确的预测病人的 预后。从治疗的角度，microRNA表达谱可能为临床上确定一个治疗方案提供一 个强有力的工具。例如，Lu等发现，microRNA特征可以成功地对于组织学上 难以诊断的癌症样品进行分类。 microRNA芯片实验主要步骤是选择芯片（或者定制，自制），样品 RNA提 取，标记和杂交，结果扫描和分析。 选择芯片 定制芯片的选择更多取决于探针设计，是microRNA芯片分析的一个关键。由 于microRNA本身长度的原因，成熟 microRNA长度不超过22个核苷酸，因此 不可能随着熔解温度（Tm）调整探针序列，利

18、用 LNA （ lockednucleicacid ）技 术可以使熔解温度升高，而且 LNA与核酸杂交有严格的序列特异性，比普通寡 核苷酸更有效地区分碱基错配。 RNA提取 标记和清洗 microRNA表达谱分析是一种对所有已知 microRNAs的表达模式进行研究的 方法，不同的 microRNA 标记方法会直接影响芯片表达谱精确性， 因此要选择合 适的 microRNA 标记系统。 由于 microRNAs 小分子的限制，标记的方法相应的收到了限制，较为常用的 标记方法是酶法和化学法。前者主要基于 poly(A) 聚合酶 I ，在纯化后的 microRNAs 的 3端上加上多个氨基染料修饰

19、的核苷酸。后者则是将荧光标记直 接通过共价作用加在 microRNA 分子上。 杂交 杂交反应的过程与一般的分子杂交过程基本相同， 杂交反应的条件要根据探针 的长度、 GC 碱基含量及芯片的类型来优化，如用于基因表达检测，杂交的严格 性较低，而用于突变检测的芯片的杂交温度高，杂交时间短，条件相对严格。杂 交完成后，后续的数据分析可以根据选择的芯片所提供的数据库进行分析。 microRNA 芯片技术缺点：尽管基因芯片技术敏感度有了很大提高，且可用于 多个microRNA同时检测，但仍有不足：；是不适用于新microRNA的发现 鉴定，此类研究可能需要用到一些新技术， 比如 microRNA 研究

20、奠基人新开发的 True 单分子测序技术( TrueSingleMoleculeSequencing )，以及约翰霍普金斯 大学等发现了新型分析技术：miRAGE等。芯片上不同的探针分子和待测分 子之间容易发生交叉反应，使得测定结果准确度低、重复性差和假阳性高。芯 片上探针与待测样本的杂交效率也不高。 基因芯片的制作和检测需要昂贵的仪 器设备。且芯片筛选得到的结果仍需要QPCR验证，筛选周期长和实验较为 繁琐。 实时荧光定量 PCR芯片系统(microRNA PCR Array) 基于探针杂交技术的 microRNAarray 技术上述的缺点，应用范围受到限制，如 能采用现有的 DNA 扩增技

21、术，则可以极大地提到 microRNA 的检测灵敏度。与 常规的 microRNA 表达谱芯片不同，实时荧光定量 PCR 芯片系统更加的简单方 便，不需标记、 操作简单、 成本较低、 并且灵敏度极高； 能在短时间内获得结果， 可同时检测多个 microRNAs 表达，且需要的 RNA 量较少，因而被广泛用于组 织中 microRNA 表达谱的构建。 但是与 mRNA 不同，成熟的 microRNA 分子很短( 18-25nt )，没有 poly(A) 尾巴，无法按常规方法设计随机引物进行反转录和PCR扩增。 经过科学家不懈 的努力，近年来发展了多种扩增 microRNA的方法，如PCR扩增法，

22、滚环扩增 法（RCA）,引物入侵法（Invader）和克隆法等。对 microRNA扩增产物的检测 方法与常规mRNA扩增产物的检测方法基本一致，主要有 SYBRGreen（SG）荧 光染料法，TaqMan探针法等。其中应用最广泛的是实时荧光定量PCR法 (qPCR)。 miRCURY LNA? Un iversal RT microRNA PCR Panel原理主要是通过大规 模的将设计并验证过的 microRNA特异性引物于96孔板或384孔板中，通过将 逆转录microRNA得到的cDNA加入到每个孔板中进行qPCR来实现microRNA 高通量分析。该技术的优势在于凭借高的 PCR扩增

23、效率，将PCR的高灵敏度 和高特异性引入 microRNA检测中。关于qPCR的原理将在microRNA定量中 详细介绍。（放置Panel筛选示意图） Step 1: First-strand synthesis (RT) 酎吕儿pa rriirrnRNA 負乙牡 AAZAA/X 代 AAAAA TTTTTTTrTTTTTTT 3 degenerate anchor 5 universal tag Step 2： Real-time PCR amplification m iR 3；:： j ? 1 f c for jr c prn n o-r rrir -speciri匚厂殳*幔岂邑pnme

24、r Bl 2.3 定量（Real-time PCR） 当用表达谱技术进行了高通量筛选之后， 则需要精确检测筛选出的 microRNA 表达水平，Real-time PCR 是精确定量的检测 microRNA的方法之一，基于成熟 的microRNA分子很短（18-25nt），没有poly（ A）尾巴的情况，目前采用qPCR 技术对microRNA进行定量检测的方法主要有三种： PE-qPCR 该法是在常规引物延伸技术（PE）的基础上建立的引物延伸定量PCR法 （PE-qPCR）。即先通过一个加尾的 microRNA特异性引物（GSP ）将microRNA 反转录成加尾cDNA，然后利用一个LNA

25、修饰的microRNA特异性反向引物 （RP）和一个与加尾序列一致的通用引物（UP）进行PCR扩增； 加尾法 先用Poly（ A）聚合酶（PAP）处理总RNA，使microRNA的3端加上一段poly （A）尾巴，然后用5端含有接头序列的poly（T）引物进行反转录，使第一链cDNA 加上一段接头，为随后的 PCR 扩增提供反向通用引物序列，再利用一条与 microRNA序列特异的LNA修饰的正向引物就可实现PCR扩增。 茎环法（stem-loop ） 利用茎环状引物逆转录 microRNA ，称为 stem-loopRT-qPCR 检测法，茎- 环反转录引物中除含有一段与 microRNA

26、互补的特异性序列外， 还含有一段较长 的共有序列，与靶 microRNA 退火反转录后，能得到一个较长的反转录扩增子 （cDNA），共有序列提供了一个通用引物结合位点， 然后通过一个与microRNA 序列特异的引物和一个通用引物进行 PCR 扩增。 以上的 qPCR 法采用的信号检测模式主要有两种： SYBR Green 荧光染料掺 入法和 TaqMan 探针法。前者成本低，基于目前常用的 LNA 技术，可以区分一 个碱基差异的 microRNA 。而且使用 SYBR Green 染料进行信号检测检测后， 可 以通过融解曲线分析 PCR 扩增的特异性，可以避免出现的非特异性扩增的假阳 性结果

27、。后者成本相对较高， 特异性也不错， 但每种 microRNA 都需要设计一个 特异的反转录引物， 若需要对样本中多个 microRNA 的定量，其从反转录到定量 PCR，工作量较大。虽说 microRNA的上游定量引物和探针是特异的，但下游 引物仍然是通用的， 且不能用融解曲线分析特异性， 因此可能会引起过度扩增或 形成引物二聚体。 2.4 原位杂交 原位杂交技术（In situ hybridization，ISH）是分子生物学、组织化学及细胞学相 结合而产生的一门新兴技术，始于 20世60年代。 1969 年美国耶鲁大学的 Gall 等(1969) 首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交

28、， 将该基因进行定位， 与 此同时 Buongiorno Nardelli 和 Amaldi 等(1970) 相继利用同位素标记核酸探针 进行了细胞或组织的基因定位， 从而创造了原位杂交技术。 自此以后， 由于分子 生物学技术的迅猛发展，特别是 20 世纪 70 年代末到 80 年代初，分子克隆、质 粒和噬菌体 DNA 的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列， 将有放 射性或非放射性的外源核酸 (即探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA 或 RNA 互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组

29、织、 细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备 3 个重要条 件：组织、细胞或染色体的固定、 具有能与特定片段互补的核苷酸序列 (即探针 )、 有与探针结合的标记物。 RNA 原位核酸杂交又称 RNA 原位杂交组织化学或 RNA 原位杂交。该技术是 指运用 cRNA 或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内 RNA 表达的一种原位杂交技 术。其基本原理是： 在细胞或组织结构保持不变的条件下， 用标记的已知的 RNA 核苷酸片段， 按核酸杂交中碱基配对原则， 与待测细胞或组织中相应的基因片段 相结合 (杂交 )，所形成的杂交体 (Hybrids) 经显色反应后在光学显微镜或电子显微 镜

30、下观察其细胞内相应的 mRNA 、rRNA 和 tRNA 分子。 RNA 原位杂交技术经 不断改进，其应用的领域已远超出 DNA 原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断 方面能作定性、 定位和定量分析， 已成为最有效的分子病理学技术， 同时在分析 低丰度和罕见的 mRNA 表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。 近年来，该技术还扩展到对细胞水平 microRNA 的检测， 80 年代后期可在福 尔马林固定、 石蜡包埋的组织中进行原位杂交， 现已扩展到细胞及亚细胞水平进 行 microRNA 的检测。该技术不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的 microRNA 表达，还可在不经分类和分离的情况下，

31、比较不同细胞系中 microRNA 的表达水 平。该方法更直观地展现了 microRNA 的空间表达模式。 之所以有如此突飞猛进的进步，主要是依赖于针对 microRNA 序列短的特性， 对传统的检测 microRNA 表达的原位杂交技术进行了大量的改进， 目前应用最广 的是将 LNA 探针应用于 microRNA 原位杂交分析。 Wienholds 等已应用 LNA 探 针在斑马鱼中检测了数百个 microRNAs 的空间表达模式。随后， Kloosterman 等对该技术的杂交条件等进行了优化，在鼠胚中检测了 15 种 microRNAs 的空 间表达模式，使其成为研究 microRNA

32、空间表达特性的最有力工具。 Darnell 等 利用 LNA 探针在早期发育的级配重高通量检测了 135 个 microRNAs 的表达。 目前，ISH数据库中收录了数百个利用LNA探针检测的microRNAs在鸡胚早期 发育中的空间表达模式。 其主要缺点是技术掌握比较困难，试验周期长。 2.5 功能实验 自首个 microRNA 的发现到第二个 microRNA 的发现，用了 7 年的时间，而 2000 年至今已有多达 8600 余个 microRNA 在不同物种体内被发现，目前， miRBase 已经记录了人类 microRNA (has-microRNA )及其亚型 1200 多个， 在

33、不断发现新 microRNA 的同时，人们也开始了对其功能的探讨。 通过 microRNA 功能研究，能够确定特定 microRNA 的目标和作用，分析单个 microRNA 失调 的生物学意义。 目前主要通过两种策略进行 microRNA 的功能研究： 正向遗传学策略， 即从具 有突变表型的生物体中寻找引起该形态生理变化的 microRNA 基因，从而进一步 确定该 microRNA 分子所起到的确切作用； 反向遗传学策略， 即首先要运用生物 信息学的手段分析 microRNA 的可能作用靶基因，然后构建待研究 microRNA 的表达载体或者合成其反义寡核苷酸， 通过合适的转染手段， 使其

34、导入细胞或生 物体，以达到对已知的 microRNA 进行过表达或反义抑制的效果，即上调某个 microRNA 获 得 Gain-of-function 表 型 或 下 调 某 个 microRNA 获 得 Loss-of-function 表型。观察由此而产生的对细胞生物表型以及生化功能方面的 影响，进而确定其生物学功能。 随着生物信息学的发展， 反向遗传学方法已经成 为现阶段研究哺乳动物 microRNA 分子功能的主要方法。 对于 microRNA 基因沉默的方法主要包括 Knockdown 和 Knockout ，目前大 多数是基于 Knockdown 技术的下调或抑制，比如 Morp

35、holinos 寡核苷酸， 2-O-methyl 寡核苷酸， LNA 修饰的核苷酸等反义核酸技术。在 in vivo 方面，为 多篇文献引用的基于体内的 LNA 修饰的 knockdown inhibitor 拥有硫代磷酸酯骨 架修饰，可降低核酸酶的进攻和降解； 50%以上的 LNA 修饰，更强的抑制效果； CpG 甲基化避免引起免疫应答。 而 microRNA 的 Knockout 技术从 2007 才开始 首次应用到小鼠方面，进行体内的功能分析和靶基因鉴定 对于 microRNA 过表达实验， in vivo 的研究方法主要是转基因过表达技术， 包括转基因斑马鱼，转基因鼠等。 In vit

36、ro 的研究方法主要是转染化学合成的 microRNA 和表达 microRNA 的表达载体(病毒载体和普通表达载体) 两种方法。 基于病毒的 miRNA 过表达可以实现 microRNA 长期和稳定的过表达。化学合成 的 microRNA 包括前体和成熟体的双链。 Pre-miR microRNA Precursor Molecules 是与细胞内特定的 microRNA 前体 结构接近的， 但经化学修饰和优化的核苷酸分子。 其能模拟体内 microRNA 自然 的剪切过程，经过加工成为 microRNA 成熟体，它能直接进入内源 microRNA 调节途径从而上调特定的 microRNA

37、分子。具有直接高效和剂量容易控制等特 性。 Morpholinos 反义寡核苷酸广泛应用于斑马鱼中的的基因 knockdown 研究。 Morpholinos 是经过吗啉代环的修饰使它更稳定它与靶序列结合后通过空间位阻 效应发挥作用，更加稳定高效，可针对 mRNA 的 5UTR 或 ATG 附近的编码区 来阻止蛋白翻译，也可以针对 mRNA 前体的剪切微点来阻止正确剪切。但它有 时会出现发育延迟和广泛性细胞凋亡等非特异现象。 在确定了靶mRNA之后，找到位于3 / -UTR区的microRNA结合位点是研究 者下一步关心的内容。 microRNA 靶标鉴定常采用报告基因检验试验的手段，该 实验

38、的原理是将待分析的 microRNA的3 / -UTR区克隆到报告基因如荧光素酶 (luciferase,luc),(Green Fluorescent Protein,GFP) ， 增强型 绿色荧光 蛋白 (En ha need GFP )或Ctx( cytotoxic sen sor)(细胞毒性感应基因)等基因后， 改变 microRNA 的表达程度，并检测荧光的强弱或细胞存活变化，从而对 3 / -UTR是否为靶标进行判断。报告基因检验实验的针对性强，置信度高，常 被用作 microRNA 靶标鉴定的判断性试验。 综上， microRNA 检测技术经历了从相对定量到定量，从低敏感度、特异

39、度到 较高敏感度、特异度的发展过程，有了很大的改进，但都存在有待完善之处。相 信随着检测技术的进一步改进，对 microRNA 的研究也会不断取得进展。 3.1 microRNA 调节生物体发育 microRNA 通过转录后水平调控蛋白质的合成参与各种生命过程。 Wienholds 等报道 microRNA 在斑马鱼胚胎发育过程中呈现空间性和时序性的动态表达模 式。近年来关于 microRNA 与组织器官形成的报道不断出现，包括心脏，血管， 肌肉，肺，肾脏，皮肤，牙齿，脑，造血系统等。 Yang 等对 Dicer 基因突变小鼠研究揭示了 microRNA 在胚胎血管形成中的重 要作用。 Sua

40、rez 等科学家观察发现内皮细胞 Dicer 基因特异剔除的小鼠对形成 血管的刺激反应降低，为内皮 microRNA 影响血管生成提供了体内研究证据。 Wang 等发现内皮细胞特异性 miR-126 调节血管发生和发育， 靶向删除 miR-126 基因的小鼠血管完整性缺失， 内皮细胞功能发生缺陷， 进而导致血管渗漏， 出血， 甚至胚胎期死亡。 3.1.1 m iRNA 调节细胞的早期发育 Tang 等通过实时定量 PCR 方法比较鼠未成熟卵子、 成熟卵子、 合子 microRNA 表达谱 ,结果显示 ,未成熟卵子在逐渐发育成熟过程中 microRNA 的表达呈现动态 变化 , 但检测可见成熟卵

41、子与合子的 microRNA 表达谱基本一致 ,而随着合子发 育由单细胞分裂增殖形成 2 细胞胚时 ,microRNA 不断被降解导致其总量下降达 60% ;在 2 细胞发育到 4 细胞期时 , microRNA 的表达又开始上调 , 其中 m iR-290 簇上调达 15 倍。比较正常小鼠与 Dicer 突变体鼠的成熟卵子基因表达 谱可见 , 部分母源性的基因表达受胞内 microRNA 分子的直接或间接调控 , 从 而表明母源性来源的 microRNA 分子对小鼠早期的胚胎发育是必需的。 3. 1. 2 microRNA 参与细胞分化和组织发育 Tay 等研究结果发现，小鼠胚胎干细胞在视黄

42、酸诱导下下第 4 天高表达 miR-134, 在 N2B27 诱导下第 2 天高表达 miR-134 。单独上调 miR-134 的表达 , 可以促进 小鼠胚胎干细胞向外胚层分化 ,且这一作用可被 miR-134 的抑制剂阻断。在肌肉 发育方面 ,Clop 等证实， Texel 绵羊中的 GDF8 基因的 3UTR 内的一个点突变产 生了可以在骨骼肌内高度表达的两个 microRNA, 即 miR-l 和 miR-206, 它们同时 作用的靶位点 ,从而引起 microRNA 介导的 myostatin 浓度在转录后降低而造成 肌肉肥大。 3.1.3 m iRNA 参与调节基因的表达 在各类小

43、分子RNA中，microRNA具有最广泛的基因调节功能。在培养的人293T 细胞试验中发现 microRNA 和 siRNA 可能通过相似的机制抑制 mRNA 的表达。 内源性人的 miR-21 通过与靶位完全互补诱导 mRNA 剪切 ,这种特性一度被认为 是 siRNA 的特性之一。相反 ,将合成的 siRNA 通过与位点错配可以下调 mRNA 的表达,而最终选择哪几种机制也许在很大程度上完全取决于其与靶没RNA的 互补程度。 3.2microRNA 与疾病 microRNA 与多种疾病的发生，发展密切相关，已经有关于与心脏病，肌营养不 良，糖尿病，肝炎，恶性肿瘤，帕金森病，唐氏综合症等疾病

44、相关的研究证据。 2002年，microRNA与肿瘤的关系首次在慢性淋巴细胞白血病中报道，此后 microRNA 在人类恶性肿瘤中的异常表达成为今年来的研究热点之一。 最初表明 microRNAs 在人类疾病中发挥重要作用的数据来自于癌细胞的 microRNA 功能研究。几个因素促成了在这一病理背景下早期评估 microRNA 的 重要性。首先， 20 世纪90年代初科学家们最早发现的 microRNA 是线虫中的 lin-4 和 let-7 ，当它们丧失功能时，诱发了肿瘤生物学的某些方面。在 lin-4 和 let-7 突变体中， 特定的干细胞谱系无法在幼虫的适当阶段发生分化， 维持了早期阶

45、段 的分裂特性， 并在进入成虫阶段后继续发生细胞分裂。 随后， 研究人员在果蝇中 发现了调控细胞增殖和凋亡的 microRNAs ，进一步确定了这些调控 RNAs 与癌 症相关信号通路之间的关联。同时 Croce 和同事们开展的一项开创新研究表明 在慢性淋巴细胞白血病（ CLL ）中 miR-15a/16-1 簇频繁缺失，表明这些 microRNAs 充当了肿瘤抑制因子。这些研究发现随后引发了近 10 年癌症中 microRNAs 功能的集中性研究。 现在基于成百上千的表达分析研究，科学家们已清楚地知道相对于正常组织， 肿瘤普遍地显示了 microRNA 表达模式失控。 microRNA 表达

46、模式为肿瘤分类和 预测提供了有用的信息。 然而，由于 microRNA 在许多情况下呈高度细胞类型特 异性表达，对这些 分析研究 的结果还 必须慎重地 解析， 因为在癌细 胞中 microRNAs 的明显失调有可能只是反映了相比于正常组织，肿瘤中存在多种不 同的细胞群。这一告诫强调了开展严密的功能试验直接评估 microRNA 功能获得 与丧失对肿瘤细胞行为影响的至关重要性。现在大量这样的试验在人类癌细胞 3.4microRNA 与干细胞自我更新调控 系、遗传工程小鼠中和多种情况下开展， 证实 microRNA 的活性显著地影响了肿 瘤发生发展。 例如，在小鼠中转基因表达 miR-155 或 miR-21 就可以触发淋巴瘤 形成。相同的，在小鼠造血祖细胞中表达 miR-17-92 簇可以加速 Myc 诱导的 B 细胞淋巴瘤形成，体外敲除这一 microRNA 位点则可诱导 Myc 驱动的淋巴瘤细 胞凋亡。与此相反，系统导入选择性 microRNAs 包括 let-7 、miR-26a 、miR-34a 和 miR-143/145 则可以抑制体内的肿瘤进展。