NativePAGE试验方法

1、Native-PAGE 实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性 sds-page 电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶 的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如 SDS 等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性 蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低 pH 凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高 pH 凝胶系统。酸性蛋白 通常在非变性凝胶电泳中采用的 pH 是8.8 的缓冲系统， 蛋白会带负电荷， 蛋白会相阳极移动； 而碱性蛋白 通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。分离酸性蛋白工作液配制1. 40% 胶贮液 (Acr:Bis=29 ：

2、1)；2. 4分离胶 Buf(1.5 M Tris-HCl ，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于 80ml 水，用浓 HCl 调 pH 8.8 ， 加水定容到 100ml ， 4 贮存；3. 4堆积胶 Buf(0.5 M Tris-HCl ，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于 80ml 水，用浓 HCl 调 pH 6.8 ，加 水定容到 100ml ，4 贮存；4. 10电泳 Buf( pH8.8 Tris-Gly ):30.3 g Trisbase ， 144 g 甘氨酸，加水定容到 1l ，4 贮存；5. 2溴酚蓝上样 Buf:1.25ml pH6.8, 0.

3、5M Tris-Cl ， 3.0ml 甘油， 0.2ml 0.5% 溴酚蓝， 5.5ml dH2 O； -20 贮存；6. 10%APS ；7. 0.25%考马斯亮蓝染色液 :Coomassie red R-250 2.5g ，甲醇 450ml ，HAc 100ml, dH2O 450ml ；8. 考马斯亮蓝脱色液 : 100ml 甲醇， 100 冰醋酸， 800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶 (10 ml)4% 堆积胶 (5 ml)2. 40% 胶贮液 (40%T,3.3%C ) 4.25ml 0.5ml3. 4分离胶 Buf

4、(1.5 M Tris-HCl ， pH 8.8) 2.5ml4. 4堆积胶 Buf(0.5 M Tris-HCl ， pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10%APS 35 l7. TEMED 15 l8. 10电泳 Buf (pH8.8 Tris-Gly ) :100ml 稀释到 1L电泳条件 :100V 恒压约 20min ，指示剂进入浓缩胶；改换 160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时， 停止电泳，整个过程约 80min 。染色和脱色 :取出胶板于 0.25% 考马斯亮蓝染色液中染色约 30min ，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶

5、板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。分离碱性蛋白要用低 pH 凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：1. 分离胶： 0.06M KOH ，0.376M Ac ， pH4.3 (7.7% T，2.67% C)；2. 堆积胶： 0.06M KOH ，0.063M Ac ， pH6.8 (3.125% T，25% C)；3. 电泳缓冲液： 0.14M 2-丙氨酸， 0.35M Ac ，pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿（ 0.002% ）为示踪剂实验操作同分离酸性蛋白。回收native-PAGE 结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：电泳结束以后， 切取部分染色， 然后根据染色结果切取含有蛋白

6、质的胶带装入处理过的透析袋中， 加 入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中 的缓冲液相同），低温电泳 2-3 小时即可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （Native-PAGE） 的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法： blue native （BN-PAGE ），clear native （CN-PAGE）， quantitative preparative native continuous （QPNC-PAGE ）。在一个典型的 native PAGE 方法中，复合物被 CN-PAG

7、E 或 BN-PAGE 分离。然后可以用其它分离 方法如 SDS-PAGE 或等电聚焦做进一步分离。 随后切割凝胶， 蛋白复合物每一个部分都被分开。 蛋白的每 个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE 是最古老的 Native-PAGE 技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染 料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物 的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。Blue Native

8、PAGE 在分析蛋白质 -蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离围 在 100KDa-10MDa 。在 Blue native PAGE 过程中， 最重要的化合物就是考马斯亮蓝， 除了增溶作用以外， 蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷， 这会导致即使碱性蛋白在 pH7.5 条件下也会向阴 极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程 中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性

9、 大大提高。1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE 是通过除染色以的其它方法如 SLS 鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大 的应用还是研究蛋白质 -蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。Clear Native PAGE 是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（ PI7 ）的电泳技术，分 辨率通常比 BN-PAGE 低。迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。因此， BN-PAGE 比 CN-PA GE 应用更广泛。然而 CN-PAGE 在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优势。如测定催 化活性（例如线粒体 ATP 合酶）或分离用于

10、荧光共振能量分析的微量膜蛋白， CN-PAGE 比 BN-PAGE 更 温和，特别是使用洋地黄皂苷时， CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而 BN-PAGE 会导致 分解。线粒体 ATP 合酶中的具有酶活性的低聚物可以用 CN-PAGE 检出，但 BN-PAGE 无法检出。CN-PAGE 起源于无色非变性 PAGE ，是 BN- PAGE 之后出现的技术。既然 CN-PAGE 中没有带电 荷的染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。大分子和低聚蛋白必须有合适的物理参 数才能在 CN-PAGE 中分开，特别是 PI 低于 5.4 ，分辨率低。由此看来， CN-PAG

11、E 除了获得未染色的蛋 白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。优点是条件更温和，在蛋白质组学研究中具有更大优势。 BN-PA GE 和 CN-PAGE 的缓冲液和电泳条件一致，但是 CN-PAGE 的阴极缓冲液中不含考马斯染料，而是将 0.025% 的洋地黄皂苷加入到凝胶中1.3 QPNC-PAGEQPNC-PAGE （ quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis ） 是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨技术。这种凝胶电泳被生物学家应 用于独立活性或天然金属蛋

12、白样品或正确或非正确折叠的可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴 定。1.3.1 电泳缓冲液QPNC-PAGE 是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。在特殊的电泳缓冲系统（基于 Tris-HCl 和 NaN3 ）中，一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷，在电场的正负极之间迁移。尽管 PH（ 10.00 ）的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理PH 相符，但是在生理 PH （8.00 ）的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。 分离系统包括电泳槽和分部收集器， 这些装置要置于冰箱中。1.3.2 凝胶特征为了得到一个 PAGE 所需的聚合完全的凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚

13、 69hr 。最后，得到 均质的含机械稳定和自由的单体或原子。凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最小化。基于上 述原因，凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。待分离的金属蛋白（如金属分子伴侣，蛋白酶感染性 初级因子，金属运输蛋白，淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。孤立 蛋白的生物活性结构（天然或 3D 构象）在 QPNC-PAGE 后不会发生构象变化。所以，金属蛋白和蛋白异 构体在 PAGE 中被定量的分成高纯度的部分。 QPNC 与其它电泳技术如 SDS-PAGE ，2-DE ，等速电泳和 CN- PAGE 等相比被称为 “突破性的方法 ”。1.3.3

14、实验方法1）储备液1)200mM Tris-HCl 10mM NaN 3 PH10.00 ，室温2）200mM Tris-HCl 10mM NaN 3 PH8.00 ，室温3）40% 丙烯酰胺 /双丙烯酰胺 2.67C ，4（新鲜）（ 2）电泳缓冲液20mM Tris-HCl 1mMNaN 3 PH10.00 （除气）， 4电泳槽上部： 500ml 电泳缓冲液电泳槽下部： 2000ml 电泳缓冲液（3）洗脱液20mM Tris-HCl 1mMNaN 3 PH8.00 （除气）， 4 洗脱室： 700ml 洗脱缓冲液（4）分离胶丙烯酰胺 4%T 体积 40ml成分：4ml40% 丙烯酰胺 /双丙

15、烯酰胺 2.67C4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN 3 PH10.00 32 mL H2O200 L 10% APS 20 L TEMEDAPS 和 TEMED 最后加入。轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。然后把溶液移入径为 28 mm ，长为 40mm 有刻度的玻璃柱中。加入 3ml 正丙醇。 60 分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶，然后用 4 ml 电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集 69 小时。（5）样品的准备和收集保持样品（生物液体）温度为 4。 0.3ml 甘油和 2.7ml 样品在分离前混合 5 分钟。然后把处理好的 样品加入到电泳缓冲液的上层。 这些

16、蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电 （PI10.0 ）， 因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续 洗脱，并用分部收集器收集。整个分离系统必须在 4冰箱中进行。纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于 QPNC 。样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉淀 等过程以防止蛋白变性。化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化。1.3.4 定量和鉴定Fe， Cu， Zn， Ni， Mo ， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd 和其它金属辅因子可以通过 ICP-M S（ Inductively coupled plasma mass spectroscopy ，电感耦合等离子体质谱）来定性和定量。因为 PA GE 条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件