小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达(一)

1、小鼠 B16 黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达（一）【摘要】目的 :克隆酪氨酸酶基因（ TYR）,并在毕赤酵母中表达和纯化 其融合蛋白 ,体外测定纯化的 TYR活性。方法 :利用技术 ,从小鼠 B16黑色素瘤细胞中克隆全长 TYR克, 隆至载体 ,进行双链核苷酸序列测定。构建 TYR毕赤酵母表达质粒并导入毕赤 酵 母 PichiapastorisGS115,表 达 的 重 组 蛋 白 用和Westernblot 进行分析 ,采用 Co2+离子亲和层析柱纯化 TYR并采用 TYR 多巴速率氧化法体外测定纯化的 TYR活性。结果 :克隆了 TYR基因。构 建了重组表达质粒 。 和

2、 Westernblot 分析显示 , 在相对分子质量 （Mr）为约 53000处出现 1 条特异性蛋白带 ,且能与兔抗 TYR抗体发生反应。结论 :克隆 TYR基因片段与基因库所登录的序列相 一致 ,并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性。【关键词】酪氨酸酶基因黑色素瘤细胞毕赤酵母 酪氨酸酶 （tyrosinase,TYR由） 酪氨酸酶基因（ TYR）编码产生 ,是黑色素生 物合成途径中的关键酶 ,其含量和活性直接影响着黑色素生成的速度和 产量。黑色素具有独特的结构和性质 ,功能多种多样 ,在人体主要存在于 皮肤、眼睛及脑黑质等组织 ,对人体提供某种形式的保护作用 ,但其

3、作用 机制尚不清楚。由 TYR 结构改变或表达失控所导致酪氨酸酶的量或者 活性发生改变临床上会引起多种色素性皮肤病的发生 1。临床上许 多皮肤病 :如黄褐斑、色素痣、白癜风、白化病等均是由 TYR结构改变 或表达异常导致酪氨酸酶的量或活性发生改变所引起。基因突变、酪 氨酸酶活性异常升高、黑色素合成过度增加被认为是恶性黑色素肿瘤 的起因 ,某些神经性疾病如着色性干皮病 ,帕金森氏综合症、 老年痴呆症 都与黑色素缺乏有关 ,这些疾病均为难治疗性疾病 ,目前尚未有特异有 效的治疗方法。因此寻找调控 TYR表达的有效方法对由 TYR表达失控 引起的多种难治疾病的防治具有重要意义。1 材料和方法1.1

4、材料总 RNA抽提试剂 TRIzol试剂购自 Pharmacia公司;DNA聚合酶为 TaKaRa 公 司 产 品 ; 兔 抗 TYR 抗 体 由 本 研 究 室 制 备;Superscr试剂盒、zeocin、Pichiapastoris表达菌株 GS115和表达载体 pPICZaA为 Invitrogen 公司产品 ;酵母提取物和蛋白 胨为 Oxoid 公司产品 ;YPDS平板（20g/L 蛋白胨,10g/L 酵母提取物 ,20g/L 葡萄糖,1mol/L 山梨糖醇,20g/L 琼脂粉）;BMGY培养基（13.4g/LYNB,20g/L 蛋白胨 ,10g/L 酵母提取物 ,0.04g/L 生

5、物素 ,100mmol/L 磷酸缓冲液 pH6.0,10mL/L甘油）;BMMY 培养基（13.4g/LYNB,20g/L蛋白胨 ,10g/L酵母 提取物,0.04g/L 生物素,100mmol/L 磷酸缓冲液 pH6.0,10mL/L 甲醇）。琼脂糖介质为 qiangen 公司产品。限制性内切酶、DNAMarker、 dNTP、T4DNA连接酶、克隆载体 pMD18 等购自 TaKaRa公司;PCR引物 由上海博亚生物技术有限公司合成。1.2 方法1.2.1 小鼠 B16 黑色素瘤细胞株常规传代培养用含 150mL/L 胎牛血清 , 青霉素和链霉素各 100mg/L的 RPMI1640,37

6、、50mL/LCO2饱和湿度环 境培养 1824h,待细胞生长至对数生长期 ,用2.5g/L胰酶消化 ,计数并收 集细胞即可抽提其 RNA。TRIzol 试剂抽提小鼠 B16 黑色素瘤细胞的总 RNA,以 14g/L 琼脂糖凝胶电泳检测有无降解 ,紫外分光光度仪测定其浓 度及纯度。1.2.2TYR 的 cDNA 克 隆 参 考 小 鼠 的 已 知 TYR 基 因 序 列 (GenBankAccessionNumberD00440利) 用计算机软 件 设 计 如 下 PCR 引 物 :PrimersP1(sense)5 (EcoRIsiteunderlined),P2(antisense)5 (

7、XhoIsiteunderlined),采用 一 步 法 合 成 目 的 基 因 , 操 作 过 程 按 推荐的程序进行。把一步法 产物用 8g/L 的琼脂糖凝胶电泳分离后 ,割胶回收目的 片段,并直接经 T/A克隆连接入载体中 ,通过菌液 PCR进行初步鉴定后进行 DNA测序鉴定。1.2.3 重组表达载体 的构建引物的设计合成根据重 组 质 粒 的 测 序 结 果与 GenBank 中 的 D00440 (GenBankAccessionNumberD0044)0 序列 ,结合 pPICZA载体的特点设 计 引 物 , 引 物 的 核 苷 酸 序 列 如 下 :5 ; 5 ; 5 ;其中引物

8、中 的单下划线序列为内切酶 XhoI的酶切位点 ;引物中的双下划线序列为 连续 5 个组氨酸的核苷酸序列 ;引物中的单下划线序列为内切酶 XbaI 的酶切位点 ,双下划线序列为连续 6 个组氨酸的核苷酸序列 ,点式下划线 为终止子序列。首先以稀释的质粒为模板 ,引物和为上下游引物进行 PCR扩增反应 ,获得的片段为一端含有内切酶 XhoI 的酶切位点 ,另 一端含有 5个组氨酸核苷酸序列的 TYR基因序列 ,命名为。接着再以稀释的为模板 ,引物和为上下游引物进行PCR扩增反应 ,获得的片段为一端含有内切酶 XhoI 酶切位点 ,另一端含有 内切酶 XbaI酶切位点的所需片段。 PCR产物经 X

9、hoI 和 XbaI双酶切后克隆至 pPICZaA表达质粒 ,经酶切及测序鉴定得到重组表达质 粒。转化毕赤酵母取 80L感受态细胞分别与 10L(5 10mg/L)SacI 线性化的 pPICZaA和重组表达质粒混合 ,于电转仪下电转化 (电压:1500V;电容:25F电; 阻:400 ; 电激次数 :1 次/ 管;时间参数 :8.9ms),涂布于 YPDS(Zeocin100mg/L抗) 性选 择平板上筛选转化子。1.2.5TYR在毕赤酵母中的诱导表达及检测挑取酵母转化子单菌落接种 于100mLBMGY中,置于500mL锥形瓶中,在30、 250300r/min 摇瓶培养至 A600=2 6

10、（大约 1618h）,酵母细胞达到对数生长期。 3000r/min, 室温下离心菌体 5min,去上清 ,菌体重悬于 100 200mLBMMY 中 ,至 A600=1。将菌体置于 500mL 锥形瓶中 ,盖上两层纱布 ,继续摇瓶培养。 每 隔 24h 加入甲醇至终浓度 5g/L,保持诱导。每隔 0、4、 48、 72、 96h,收 集培养物 1mL,12000r/min 离心 1min,取上清贮于 -20,等待分析。将发 酵上清液进行电泳（50g/L浓缩胶,120g/L 分离胶）,并用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。将电泳凝胶上的蛋白转印到硝酸纤维素膜上 , 用兔抗 TYR抗体进行 Western

11、blot 分析。1.2.6TYR蛋白的大量纯化产物经离子纯化柱纯化、复性。加酵母上清液（含目的蛋白）至树脂中 ,轻轻混合 3 5min,然后 用 10 倍体积的 pH8.0 的 20mmol/L 磷酸钠、 300mmol/L 氯化钠溶液冲 洗纯化柱。目的蛋白用含有 烷基咪唑的 pH8.0 的 20mmol/L 磷酸钠、300mmol/L 氯化钠溶液洗脱 ,具体步骤参照产品说明 书进行。纯化的重组 TYR蛋白可以用于活性测定实验。1.2.7 酪氨酸酶活性测定方法采用酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸 酶 活 性 。 反 应 混 合 物 2mL:0.1mol/LpH6.5PBS1.8mL 酪 氨 酸 酶 0.2mL（20mg/L）。 37孵育 10min,加多巴 1mL,2、 3、4、5、6min 时 ,用分光光度计测定 A475 值,以每分钟 A475 增加 0.001 定为 1 个酶活力单位。以PBS液为空白,蘑菇TYR反应组为对照 ,测定TYR活性。2 结果2.1TYR基因 cDNA 的克隆、表达和纯化采用一步法直接以小鼠 B16黑色素瘤细胞总 RNA为模板扩增出了 1 条特异的目的产物 ,大小 在 1700bp 左右 ,与预期大小一致。将