实验三培养基的制备灭菌及生活饮用水中细菌总数测定

1、实验三 培养基的制备灭菌及生活饮用水中细菌总数测定、实验目的和要求 掌握微生物培养基和无菌水的制备方法；学习实验器材及培养基等灭菌方法。 验证性实验，实验时数可安排为 2 学时。二、实验设备与仪器1培养皿 15-20 套，试管 6 支-10 支，移液管 10 mL 1 支，1 mL 2-4 支，锥形瓶 2个， 烧杯 300 mL 1 个，玻璃珠。 120 mL 三角瓶 1 个。2纱布、棉花、牛皮纸、报纸、细铁丝、厌氧袋。3. pH 试纸 6-8 （或 pH 仪）、10% HCI、10% NaOH。4牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。 5.高压蒸汽灭菌装置、烘箱、电炉、冰箱、净化工作台。三、

2、实验前准备工作1. 预习实验指导书实验三的内容。2. 复习课堂教学有关微生物营养和培养基制备原则，微生物的灭菌原理等内容。四、实验注意事项1. 实验过程中使用高压灭菌装置应严格按照操作规程进行，才能达到灭菌效果。使用 时应注意安全操作。五、实验原理灭菌是用物理、化学因素杀死全部微生物的营养细胞和其芽孢（或孢子）。消毒是用物理、化学因素杀死病原微生物和部分微生物。灭菌方法有高温灭菌、紫外线灭菌、 超声波灭菌、 灼烧灭菌等，消毒方法有化学试剂消 毒、过滤消毒等。高温灭菌是主要灭菌方法。 高温灭菌常有两种方法， 干热灭菌和高压蒸汽灭菌。 高压蒸 汽灭菌时湿热的穿透力和热传导强，湿热时微生物吸收高温水

3、分，菌体蛋白容易凝固变性。高压蒸汽灭菌的温度是 121oC，灭菌15-30分钟；干热灭菌温度是 160 C,灭菌2小时。六、实验内容1. 玻璃器皿的洗涤和包装,灭菌前的准备工作；2为下个实验制备所需的培养基和无菌水；3学习高压蒸汽灭菌技术；七、实验方法与步骤1. 玻璃器皿的洗涤与包装(1) 洗涤：培养皿、试管、三角瓶用毛刷蘸洗涤剂洗刷T用自来水冲洗干净，不挂水珠为止t 105 C烘箱烘干，待用。移液管先用洗液浸泡 t用镊子取出t自来水冲洗干净t烘箱烘干备用。(2) 包装：1) 培养皿15-20套，用牛皮包装 t棉线包扎t待灭菌；2) 移液管包装：移液管10 mL 1支，1 mL 2支t移液管的

4、吸入端用铁丝塞入少 许棉花t约1-1.5 cm长棉签t用4-5 cm宽的长纸条从一方向包裹移液管至另一端t多余纸打结，以达密封效果；3) 试管、三角瓶的包装：取试管 5-10 支，在试管和瓶口加棉塞 t 棉塞插入瓶口中 2/3， 试管用报纸包装 t棉线包扎t待灭菌。2. 培养基制备(1) 配制溶液：按实验中培养微生物种类选取培养基配方。例，营养琼脂培养基的配制：在天平上称量：蛋白胨 1克，牛肉膏0.3克，氯化钠0.5克t放入300 ml烧杯中 t加100 ml蒸馏水t在电炉上加热，用玻棒不断搅拌溶解 t加入1-2克琼脂t加热不断 搅拌至溶解。(2) 用蒸馏水补充因蒸发损失的水分。(3) 用 1

5、0% NaOH 或 10% HCl 调培养基 pH=7.4-7.6；(4) 过滤：乘热用纱布或药棉在漏斗中过滤培养基 t 分装在三角瓶中加塞 t 待灭菌。 要求：配制细菌培养基、真菌培养基、放线菌培养基、厌氧培养基等。3. 无菌水制备三角瓶中加200 mL自来水t加数粒(10-30粒)玻璃珠t加棉塞t用纸包装t 待灭菌。4. 灭菌方法(1)高压蒸汽灭菌1) 加压前的准备工作高压锅内加水至水位线 t 放入待灭菌的器皿和培养基 t盖上灭菌器盖 t打开排汽阀T接通高压锅电源 T锅内水沸腾T驱净锅内冷空气 T排气口蒸汽猛烈且微带蓝色 t关 闭排气阀T加压。2）加压：关闭排气阀 T 压力表上压力上升至

6、1.05 kg/cm2，温度121 C,开始灭菌 宀恒 温至15-30 min宀 关闭电源，火菌结束。3）待锅内温度降至室温时 T打开放气阀T打开锅盖T取出灭菌的物品（注 意不能将包装纸折开，否则已灭菌物品会重新被污染！）（2）高温干热灭菌玻璃器皿和金属器皿包装 t烘箱160C烘2 h t关闭电源t待温度降为室温取出 已灭菌的物品。（3）灼烧灭菌接种环：接种针或瓶口可在酒精灯火焰上灼烧达到灭菌效果。5. 细菌总数的测定（1）生活饮用水中细菌总数的测定1） 以无菌操作方法用灭菌移液管取1 mL自来水样至灭菌的培养皿中，加入15 mL约45 C营养琼脂培 ，养基， 立即旋摇平皿。2）同时，再做一个平行样和一个空白样。3） 待培养基凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37恒温箱培养24小时，进行菌落 计数，即为1 mL水样中的细菌总数。八、实验数据整理1 配制培养基成分实验记录，见表3.1表3.1配制培养基成分实验记录序号培养基成分名称数量备注pH2. 高压蒸汽灭菌的实验条件记录，见表3.2表3.2高压蒸汽灭菌的实验条件记录咼压蒸汽火菌温度工作压力火菌时间备注（待火菌物品名称）表3.3细菌总数测定记录水样名称取样体积菌落