血清学试验指导汇编

1、实验目录实验一：0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液的制备实验二：1% 鸡红血球悬液的制备实验三：禽流感血凝试验实验四：禽流感血凝抑制试验实验五：口蹄疫病毒 3ABC-ELISA 抗体检测技术实验六：猪瘟 病毒 ELISA 抗体检测技术实验一 0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液的制备一、目的要求掌握磷酸盐缓冲液的制备方法，为后续的血清学检测奠定基础。二、药械及耗材电子天平，小电炉，药匙， 1000ml 烧杯，玻棒， 500ml 三角瓶（带棉塞）， pH 试纸；Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaCl、蒸馏水；1 N NaOH、1N HCl（滴管瓶塞）三、试验程序配方： Na2HPO

2、4.12H2O2.9克KH 2PO40.3克NaCl8.0克蒸馏水1000ml将上述成分称量在烧杯中，加热搅拌溶解，待完全溶解以后，调整 pH 值至 7.4。然后分装在 3 个三角瓶中（每瓶大约 330ml），加棉塞，橡皮筋捆扎，置高 压灭菌器中 121 15min 灭菌处理，备用。实验二 1 鸡红血球悬液的制备一、目的要求掌握鸡红血球悬液的制备方法，为后续的血凝和血凝抑制试验奠定基 础。二、药械与耗材公鸡，玻璃注射器（ 30ml），16大针头， 5柠檬酸钠； 800 型离心机， 玻璃离心管 （10ml），洗耳球， 10ml 移液管， 2ml 移液管，棉花；0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液

3、。三、试验程序 从心脏采集公鸡的抗凝血约 25ml ，平均分装 3 支离心管； 作对称平衡以后， 3000rpm 离心 10min，弃上清液，保留红血球泥； 加入适量 PBS，用乳头滴管轻轻地洗涤红血球， 然后作对称平衡， 3000rpm 离心 10min，弃上清液，保留红血球泥； 重复上述操作 23 次，直至上清液清亮透明； 用 10ml 移液管轻轻地吸去上清液弃之，保留红血球泥； 用 10ml 移液管向三角瓶中加入 49.5mlPBS，再用 2ml 移液管吸取 0.5ml 红血球泥，棉花擦去移液管外壁粘附的红血球。将 0.5ml 红血球泥放入 49.5mlPBS 中，混匀置于 4冰箱备用。

4、实验三 禽流感血凝（ HA）试验一、目的要求流感病毒颗粒表面的血凝素（ HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受 体结构， HA试验由此得名。本试验是目前 WHO进行全球流感监测所普遍采用的 试验方法。可用于流感病毒分离株 HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否 有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。二、药械与耗材磷酸盐缓冲液、 3.8%柠檬酸盐溶液、 96孔 V型血凝板、 50L 移液枪、 25L 移液枪、微量振荡器。 1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。三、诊断试剂和待检样本禽流感病毒血凝素分型抗原。四、试验程序 在微量反应板的 112 孔均加入 25L PBS，换滴头。 吸取 25L 病毒悬

5、液加入第 1 孔，混匀。 从第 1 孔吸取 25L 病毒液加入第 2 孔，混匀后吸取 25 L 加入第 3 孔， 如此进行对倍稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取 25L 弃去，换滴头。 每孔再加入 25L PBS。 每孔均加入 25L 1% 鸡细胞悬液（注：勿必将红细胞悬液摇匀） 。 振荡混匀，在室温（ 2025）下静置 40 分钟后观察结果（如果环境温 度太高，可置 4环境下）。对照孔红细胞将成为明显的钮扣状沉到孔底。结果判定： 将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌） 的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（ HAU ）。以使红细胞 100%凝集 的抗原最高稀释倍数作

6、为血凝效价。实验四 禽流感血凝抑制（ HI ）试验一、目的要求流感病毒颗粒表面的血凝素（ HA）蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干 扰 HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株 HA亚型的鉴定，也可 用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。二、药械与耗材磷酸盐缓冲液、 3.8%柠檬酸盐溶液、 96孔 V型血凝板、 50ul 移液枪、 25ul 移液枪、微量振荡器。 1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。三、诊断试剂和待检样本禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。四、试验程序根据 HA 试验结

7、果配制 4HAU 的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍 数作为终点， 终点稀释倍数除以 4，即为含 4HAU 的抗原的稀释倍数。 例如，如 果血凝的终点滴度为 1： 256，则 4HAU 抗原的稀释倍数应是 1：64（256/4）。 在微量反应板的 111孔加入 25ulPBS，第 12孔加入 50L PBS。 吸取 25ul 血清加入第 1 孔内，充分混匀后吸 25L 于第 2 孔，依次倍比 稀释至第 10孔，从第 10孔吸取 25L 弃去。 111 孔均加入含 4HAU 混匀的病毒抗原液 25L，室温静置至少 30 分钟。 每孔加入 25L 1%鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约 40

8、分钟，对 照红细胞将呈钮扣状沉于孔底。结果判定：以完全抑制 4HAU 抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 滴度。只有 阴性对照孔血清滴度不大于 22，阳性对照孔血清误差不超过 1 个滴度，试验结 果才有效。HI 价小于或等于判定 HI 试验阴性；HI 价等于 23为可疑需重复试验 ;HI价大于或等于 24 为阳性实验五 口蹄疫非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验(NSP 3ABC-I-ELISA)一、目的要求口蹄疫 (FMD)是一种高度接触性传染病 ,传播迅速 ,可形成世界性大流行 ,对 养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。 控制和消灭 FMD 策略包括疫苗 免疫和屠宰可疑畜群在采用疫苗的国家

9、,大多数动物血清口蹄疫病毒 (FMDV) 结 构蛋白和病毒相关抗原 (VIAA, 即 3D) 抗体均为阳性。因此 ,一些基于结构蛋白和 VIAA 的诊断方法很难确定口蹄疫病毒感染与否。 只有将感染动物和隐性带毒动 物与疫苗免疫动物加以区分， 才能为 FMD 的控制和消灭提供科学的依据。 目前 的疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白，因此灭活疫苗 免疫动物体内没有病毒非结构蛋白 3BC 抗体产生，而自然感染动物体内既有结 构蛋白抗体，也有非结构蛋白 3ABC 抗体。因此检测 FMDV 非结构蛋白 3ABC 抗体的 ELISA 方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分感染动物和免

10、疫 动物。本试验采用 FMD NSP 3ABC-I-ELISA 试剂盒检测 FMDV 非结构蛋白 3ABC 抗体。用于活畜进口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和 免疫动物。二、药械及耗材2ml 指弹头离心管，吸水纸， 110ul 移液枪， 10100ul 移液枪,500ul 移 液枪， 250ml 烧杯，液体稀释槽，小、中、大移液枪尖。三、诊断试剂和待检样本3ABC-I-ELISA 诊断试剂盒、待检血清样本。四、试验程序 将试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 用无离子水或蒸馏水做 1 ：25 倍稀释待 待检血清样品和阳性、阴性对照血清用血清稀释液 1 ：21 倍稀释（ 120ul 血清稀释液加血清 6ul），每孔加入 100ul，阴、阳性对照血清样品平行加两孔， 用封口膜封口， 37结合 30 分钟。 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤 5 次，最后一次拍干。 用血清稀释液按 1： 100 比例稀释酶标二抗，每孔加入 100ul ，用封口膜 封口， 37结合 30 分钟。 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤 5 次，最后一次拍干。 每孔加入 50ul 底物溶液 B（H2O2）和 50ul 底物溶液 A（ TMB）混匀。封 口膜封口， 37避光作用 10-15 分钟。 每孔加入 100ul 终止液（ H2SO4）。