用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能汇编

1、摘要：项目研究内容和意义简介 (限 400 字)： RNA干扰( RNA interference,RNAi )是由双链 RNA介导的 序列特异性的 mRNA降解所致的转录后基因沉默过程。 RNAi 技术可方便快捷地研究基因的功能，并 用于功能基因的筛选。 本课题拟采用 RNAi 及胚胎干细胞体外定向分化技术， 将我室新克隆的精子发 生相关基因 znf230 的 siRNA 通过慢病毒( Lentivirus )系统引入小鼠胚胎干细胞，体外模拟精子发 生过程， 而在细胞水平上研究 znf230 基因表达受抑后对生精的影响， 同时结合基因表达谱芯片及蛋 白组二维电泳 - 质谱技术实现基因功能性及

2、蛋白质表达筛查，以期全面研究该基因的功能。 上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型， 亦为 RNAi 技术的应用研究拓展了新的思 路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能 研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。报告正文一)立项依据与研究内容 (4000-8000 字)：1. 项目的立项依据 (附主要的参考文献目录 )人类基因图谱解码已经完成。 进入功能基因组学时代后， 疾病相关基因以及 重要功能基因的分离、 定位、克隆表达已日益加速。 而随着新基因的分离与鉴定， 对这些基因的功能进行系统的研究将成为

3、这一时期的主要任务。 因此，建立或开 发新的或实用的基因功能研究技术平台具有重要意义。在功能基因组研究中， 酵母杂交系统、DNA 芯片、反义 RNA 、基因敲除 (gene knock-out)等技术为解读基因功能提供了有效的手段。其中基因敲除虽是基因功 能研究的经典技术 1，但由于外源及靶 DNA 发生同源重组的几率极低，重组体 的筛选及检测即成为该技术的瓶颈， 难以适应大规模的基因功能研究。 近年来发 展起来的 RNA 干扰(RNA interference，RNAi) 技术作为特异性抑制基因表达的方 法，已成为生命科学领域研究的热点。 其优点是可以简便地制备特定基因缺失表 型的个体，较快

4、捷地研究目的基因的功能， 并使系统性、 高通量功能基因筛选成 为可能。RNAi 现象首先在秀丽新小杆线虫 (C.elegans)中被发现。它通过双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 介导的同源靶 mRNA 的特异性降解，在转录后水 平使基因沉默 (Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS)2,3。RNAi 技术现已成功 运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动 物等生物体的功能研究中 4,5，而在哺 乳动物细胞内转染 21-25 nt长度的 siRNA 也可以诱导特异性的基因沉默 6，虽然 这种效应具有瞬时性。目前，多个研

5、究小组 7-10已将靶向特异基因的 shRNA 表 达质粒导入细胞，在聚合酶依赖性 H1 或 U6 启动子控制下获得 siRNAs 的持 续表达并导致了靶基因特异、 持续的下调，这为RNAi 用于长期功能缺失型研究 提供了新的思路。 然而，目前在 RNAi 应用研究中仍存在如下一些问题亟待解决， 如：1) shRNA 表达载体对某些靶基因虽能取得较明显的 RNAi 效应，但多数仍呈 瞬时性，且受到转染效率、细胞类型等因素的限制，难以获得长期的 “knockdown”效应。2) 并非所有的组织或细胞的靶基因对 RNAi 敏感；某些基因的表型鉴定本身 就存在困难，一定条件下需用特定的基因传递系统在

6、模型中加以证实。3) 目的基因序列上 siRNA 模板的选择无统一标准。实际操作中往往是试探性 的，选择不同序列 RNAi 效应差别大，抑制率可从 0 90不等。因此，建立高效、 稳定长期表达的 RNAi 传递系统正是该领域目前研究的关 键。虽然逆转录病毒的运用能有效地降低靶基因的表达 11，但 MMLV 类病毒自 身特点及对细胞类型的选择性使其应用受到一定的限制。 当前，新型第三代慢病 毒(Lentivirus) 系统正以其高效、稳定的特性在 RNAi 研究中倍受关注。 Lentivirus 来源于 HIV-1 病毒，其宿主细胞范围广泛，包括分裂细胞、非分裂细胞、原始细 胞等，且转基因在生殖

7、系统中可稳定传递 12,13。Pfeifer14 等的研究结果表明， Lentivirus 介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞 (Embryonic Stem, ES)体内、外分化 过程中表达，将 Lentivirus 感染的 ES 细胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，发育的新 生鼠及其子代的多种组织中均可检测到转基因。 Tiscornia15等将沉默 GFP 的 Lentivirus 感染 GFP阳性转基因鼠卵细胞， 发现新生鼠体内 GFP荧光蛋白的表达 明显降低。Rubison16等运用 CD8/CD25 siRNA 的 Lentivirus 载体转染鼠 ES细胞， 生成了 “ knockdown”转

8、基因鼠，其效应维持长达 30 天之久并可传递下一代， 充分显示了该方法的优越性。精子发生是一个复杂的多阶段的细胞分化过程， 涉及生精细胞的生长、 分裂、 分化和信号传递等， 要求一系列基因表达的精确调控 17,18。这些基因的异常将导 致精子发生障碍， 表现为寡精症或无精症。 近年来我室分离克隆了一系列可能与 精子发生相关的基因 19-22 ，目前已初步阐明了这些基因的结构与表达， 如 ZNF230 在无精症患者睾丸组织中无表达， znf230 在小鼠睾丸内特异表达且可能在精细胞 (spermatid)形成阶段起重要作用 22 。由于生精过程极其复杂，这些基因的调控及 其生物学功能尚未明了。

9、为探索此类问题， 首先需建立供研究的模型系统。 2003 年末， Toshiaki Noce研究小组 23成功地将小鼠 ES细胞在体外定向 分化成精子。 研究中，悬浮培养的 ES细胞在 BMP4 刺激及拟胚体立体空间构型的影响下向原 始生殖细胞 (primordial germ cells, PGCs)分化，具PGCs性质的 ES细胞 aggregation 移植至裸鼠的睾丸囊中即可发育成成熟的精子。此外， Daley 及 Geijsen 等研究 小组24也报道了 ES 细胞体外分化成精子的新进展。基于以上 RNAi 研究所取得的成果，结合鼠 ES 细胞体外定向分化新技术， 我们设想如能将 L

10、entivirus 系统引入小鼠 ES 细胞使之长期稳定表达、 发挥 RNAi 效应，则可模拟兴趣基因在特定疾病中的异常表达情况， 进而确定其功能。 因此， 可将 ES 细胞在体外定向分化成精子，即体外模拟精子发生过程，在细胞水平上 研究某一精子发生相关基因表达受抑后对生精的影响， 以期全面研究该基因的功鉴于此，本课题在前期研究工作的基础上， 拟运用生物信息学及 RNAi 载体 构建新技术对我室新克隆的基因 znf230(GenBank ID:AF353167) 进行有效 siRNA 序列筛选、靶位证实，生成高效表达的 Lentivirus 载体系统并引入小鼠 ES 细胞， 阻断znf230的

11、表达(6个有效的 shRNA串联片段使 RNAi 抑制率至少达 90以 上 )。在精子体外分化模型的细胞水平上， 为了有效地获取精子发生过程中 znf230 相关基因的表达、网络调控及其功能信息， 将结合基因表达谱芯片技术的高通量、 快速、敏捷、平行性等特点，对照研究 znf230 表达被抑后表达谱的变化，以实 现高通量的基因功能性筛查 ；同时运用 经典的蛋白组学 二维电泳 -质谱技术来研 究 znf230 被抑制后的蛋白表达变化，实现对蛋白质的表达进行原位筛查，以期 分离鉴定有功能意义的蛋白。目前国内对 RNAi 的研究刚刚起步，我们利用 Lentivirus RNAi 系统建立的 znf2

12、30 基因功能研究方法， 在设计理论与技术上均与国际上的有关研究位于同一 起点。上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型， 亦为 RNAi 技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其 合理有效， 将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型， 并在后 续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。参考文献1. Lockhart PJ, OFarrell CA, Farrer MJ. Its a double knock-out! The quaking mouse is a spontaneous deletion of parkin and p

13、arkin co-regulated gene (PACRG). Mov Disord, 2004, 19(1):101-104.2. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, and Bartel DP. RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell, 2000, 101:25-33.3. Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. An RNA-direct

14、ed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophia cells. Nature, 2000, 404:293-296.4. Ravi S. Kamath, Andrew G. Fraser, Yan Dong, et al. Systematic functional analysis of the caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature, 2003, 421(16):231-237.5. Carmell MA, Zhang L, Conklin D

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17、8): 5515-5520.9. 汤富酬, 杨红波, 孟国良等. Cos-7细胞中小发夹 RNA介导的 RNA干涉. 遗传学报, 2003, 30(4):295-300.10. McCaffrey AP, Meuse L, Pham TT, et al. RNA interference in adult mice. Nature, 2002, 418(6893):38-39.11. Barton GM, Medzhitov R. Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sc

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19、 gene delivery. J Virol, 1998, 72(12):9873-9880.14. Pfeifer A, Ikawa M, Dayn Y , et al. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002, 99(4):2140-2145.15. Tiscornia G, Singer O, Ikawa M, et al.

20、 A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors expressing small interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(4):1844-1848.16. Rubinson DA, Dillon CP, Kwiatkowski AV, et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cell

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23、or of fertilization promoting peptide. Mol Hum Reprod. 2002 , 8(1):24-31.20. Zhang S, Qiu W, Wu H, et al.The shorter zinc finger protein ZNF230 gene message is transcribed in fertile male testes and may be related to human spermatogenesis. Biochem J. 2001,359(Pt 3):721-727.21. Wu H, Zhang S, Qiu W,

24、et al. Isolation, characterization, and mapping of a novel human KRAB zinc finger protein encoding gene ZNF463.Biochim Biophys Acta. 2001, 1518(1-2):190-193.22. Qiu W, Zhang S, Xiao C, et al.Molecular cloning and characterization of a mouse spermatogenesis-related ring finger gene znf230. Biochem Bi

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26、 项目的研究内容、研究目标 ,以及拟解决的关键问题。研究目标:(1) 通过在 ES细胞水平的功能研究，阐明 znf230在精子发生过程中所起的作用；(2) 利用 RNAi 及 ES细胞体外定向分化技术，明确 znf230在精子发生何 阶段起 作用；(3) 结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳 -质谱技术实现基因功能性及蛋白质 表达筛查，以期获得与 znf230 相关的基因网络调控信息并分离鉴定有功能意 义的蛋白；(4) 利用 Lentivirus RNAi 系统建立一种精子发生相关基因功能研究的模型。研究内容：(1) Lentivirus 高效表达载体系统的构建 ；(2) Lentivirus

27、病毒生产及感染小鼠 ES 细胞；（3）ES 细胞体外定向分化模型的建立；（4）宿主鼠精子细胞的收集、分析鉴定；（5）体外培养 FACS 纯化的圆形精细胞， 结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳 - 质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查。拟解决的关键问题：（ 1） Lentivirus 高效表达载体系统的构建 是本课题的关键：运用生物信息学及 最新载体构建技术（Lentivirus 载体携带 6 个串联 shRNA），对有效的 znf230 siRNA 片段进行筛选、靶位证实，以使 RNAi 抑制靶基因的效率至少达 90以上。我们将同专业从事 RNAi 的研究机构合作，开发有效的靶向 znf23

28、0 的 Lentivirus 载体系统。（ 2） ES 细胞体外定向分化模型的建立是本课题的关键。操作中，我们将 Lentivirus 载体自身携带的 GFP报告基因用于 ES 细胞分化过程的鉴定， 代替了文献中 GFP 或 Lacz knock-in 载体的构建，而只需用 FACS 分选 即可达到同样的目的。 这将大大降低实验技术性难度， 增加了操作的可行 性。分化实验中的其他技术和方法基本上是成熟的实验方法或有相关文献 可以参照。因此， ES 细胞体外分化模型的建立将不存在技术难题。（ 3） 基因表达谱芯片技术及蛋白质 二维电泳 -质谱技术亦是本课题研究的关 键：基因芯片可以与专业从事芯片

29、研究开发的公司合作； 申请者所在的人 类疾病基因组学研究室是教育部人类疾病生物治疗重点实验室的一部分， 拥有先进的供蛋白组学研究用的设备及仪器， 并有此方面丰富的经验， 因 此经典蛋白组学研究方面将不存在技术及方法学方面的问题。3. 拟采取的研究方案及可行性分析研究方法：主要研究方法包括： RNAi 、生物信息学、 DNA 分子克隆技术如表达载体的 构建、 Lentivirus 病毒的包装及生成、 ES 细胞培养技术、 RT-PCR、细胞免疫组 织化学技术、流式细胞检测及细胞分选技术、 Aggregates 移植技术、基因表达谱 芯片技术、二维电泳 -质谱技术等。技术路线：(用下列流程图表示)

30、基因表达谱芯片及二 维电泳 -质谱技术筛查 基因及蛋白表达变化初步确定 znf230 基 因的生物学作用综合分析 znf230 基 因功能、结论实验方案：(1) Lentivirus 载体构建： 运用计算机生物信息学， 对 znf230 siRNA 靶序列进行筛选、靶位证实，将 6 条最佳的 shRNAs 串联构建入 LentiLox3.7 ， 如下图所示(2) Lentivirus 病毒生产及感染 ES 细胞：利用重组 LentiLox3.7 及包装病毒 VSVG 、 RSV-REV 、 pMDL g/pRRE 按 Lentivirus 生成程序生产高滴度 Lentivirus，感 染小鼠

31、E14TG2a ES(XY)细胞，FACS分选 GFP阳性克隆。 实验中包括阴性及空白对照 Lentivirus 感染组。(3) ES细胞体外定向分化实验：A) 体外悬浮共培养 表达 BMP4的 M15 滋养层细胞与 GFP阳性 ES 克 隆，以生成细胞集结(aggregation)及拟胚体(Embryoid body, EB)。B) 运用 RT-PCR 鉴定 Oct4、Mvh、Gfp、Fragilis 、Stella、BMP8b 基 因的表达，运用免疫组织化学技术证实 GCNA1 及 SYCP3(原始 生殖细胞特异)的表达。C) 运用 FACS 2次纯化 A)中共培养 ES细胞及 M15 细

32、胞1天后混合 物，使纯化率 95%。D) 获取 E13.5孕鼠(Slc:ICR) 雄胚胎性腺细胞，与 C)细胞共培养 16h， 生成的细胞集结移植入 CD-1 (ICR) 雄性裸鼠睾丸囊内。实验中设 立性腺细胞、未分化 ES细胞、未纯化 ES 细胞移植对照组。(4) 精子生成分析、鉴定：移植 6-8 周后，分离由 ES细胞发育的曲精管，观 测精子 的形成。如无精子发生，制作曲精管切片，用细胞遗传学方法确 定精子发生阻滞的阶段；若有精子发生，收集精子，检测相关精子生物 学指标，并与对照组比较。(5) 体外培养圆形精细胞：若有精子发生，分离圆形精细胞， FACS 分选鉴 定并进行 体外培养、增殖。

33、(6) 基因及蛋白表达筛查：利用基因表达谱芯片技术，对照研究圆形精细胞 基因表达的变化， 并在此基础上运用 2D-PAGE-质谱技术对照研究圆形精 细胞蛋白表达的变化，并由此分离鉴定有功能意义的蛋白。(7) 结合以上研究结果，综合分析 znf230 基因在小鼠精子发生过程中的作用。可行性分析 ：1 课题组成员参加过涉及基因敲除等转基因鼠生成的全过程工作 （与上海转 基因动物实验中心合作， 在 863 课题的资助下进行， 目前已初步建立了该 技术平台 ），熟练掌握了相关技术的关键步骤， 如 ES细胞培养、胚胎的移 植技术。这为本课题的实施提供了提供了良好的技术支持， 完全可以完成 该课题的 ES

34、 细胞操作部分。 此外，申请人所在实验室与以色列 Weizmann 科学研究所 Groner 教授实验室具有稳定合作关系，在本课题实施过程中 可能派人员在该研究所进行部分实验。 因此，本课题的实施将不存在技术 难题。2 ES 细胞体外定向分化模型的建立是本课题的关键。操作中，我们采用 相对简便、易行的技术，增加了操作的可行性（见拟解决的关键问题部分） 。 因此， ES细胞体外分化模型的建立亦不存在技术难题。3 在 Lentivirus 载体构建技术上，我们将同武汉专业从事 RNAi 研究开发的 Genesil 公司取得商业上的合作，以实施最佳 siRNA 片段的筛选、靶位证 实及载体构建。4

35、目前我们已经开展了 RNAi 研究工作。在前期研究工作中，已经成功地运 用了 Lentivirus 及 PAVU6+27 载体，并构建了靶向 EGFP、c-myc、Dsred2、 hTERT、hTR 等基因在内的 15 条 shRNA 片段，初步的细胞转染 /感染取 得了较好的干扰效应， 其他研究工作正在进展中。 因此，我们在载体构建、 细胞转染、 筛选、病毒生产等技术操作上拥有丰富的积累。 这是实施该课 题成功所具备的可贵经验。5 本实验室是“人类疾病生物治疗教育部重点实验室”和“四川省疾病基因 组学和法医学重点实验室” 的主要组成单位。 具备完成课题所需的一切先 进设备和条件，且各种硬件均

36、处于工作状态。综上所述，本课题的设施具有可行性。4. 本项目的特色与创新之处 ：1）结合 RNAi 研究的新进展，探索一种同时能高效表达 6个siRNAs的 RNAi 载体构建新方法；2）将在生殖系统中高效、 长期、稳定表达的 Lentivirus RNAi 载体用于精子发生相关基因的功能研究，可望获得长期的基因knoc-kdown”效应。3）将 RNAi 这一强有力的基因功能研究工具与胚胎干细胞体外定向分化技 术相结合，在精子发生的细胞水平上研究 znf230 基因的功能。该 技术平 台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为 RNAi 技 术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚

37、未见文献报道，如能证明其 合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模 型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。4）将蛋白组学技术与基因功能研究结合起来， 这在理论上可直接导致生物 学的新发现。5. 年度研究计划及预期研究结果 ：年度研究计划 ：鉴于本领域面临的国际竞争，部分实验内容已开始进行， 经费拟先自筹预支。2003. 32003.12 实验准备和前期实验。实现 shRNA 表达载体的构建， 如 ZNF463 、ZNF313、znf313、 EGFP、 c-myc、Dsred2 等 PAVU6+27 或 Lentivirus 重组载体， 初步转染 / 感染

38、哺乳动物细胞， 寻 求最佳实验方案（目前载体构建已完成） ；2004.12004.12 与 Genesil 公司合作，运用生物信息学及最新载体 构建技术实现有效靶序列的筛选、靶位证实，构建 znf230 等在内的 Lentivirus相关载体，生产病毒；2005.12005.12 ES细胞的体外培养； Lentivirus 病毒感染 ES 细胞； ES 细胞体外定向分化模型的建立（可能与 Weizmann 研 究所合作研究）；2006.12007.6圆形精细胞的分离、 纯化， 体外培养扩增， 基因表达谱芯片及 二维电泳 -质谱技术筛查基因及蛋白表达变 化；精子细胞的收集、分析鉴定；2007.6

39、2007.12 总结分析实验结果， 补充部分实验， 撰写论文， 申 请成果鉴定等。预期研究成果 ：1) 通过对 znf230 基因功能的研究，阐明其在精子发生中的作用及其作 用的阶段性。2) 获得精子发生过程中 znf230 相关基因的表达、网络调控及其功能信 息，可望分离鉴定出有功能意义的蛋白。3) 建立 Lentivirus RNAi 系统的精子发生相关基因功能研究技术平台， 为无精症病因学研究提供理论依据。4) 出席国内外重要学术会议交流 2-3 次，在国外较高影响因子的 SCI 杂志上发表相关研究论文 2-4 篇，可能申请专利 1-2 项。二)研究基础与工作条件 ：1 工作基础1) 已具备本实验所需的包括 HEK293、Cos、MCF-7 、Hela、HepG2、k562 等哺乳动物细胞株，具备 RNAi 研究用 PAVU6 27，Lentivirus 及其包 装载体(VSVG、RSV-REV、pMDL g/pRRE)，已获得供研究用的 ES细胞 株。RNAi 实验工作已从 2003年 3月开始，目前已构建了