离心技术的应用综述

1、离心技术的应用综述离心技术( centrifugal technique )是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到 一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。这项技术应用很广， 诸如分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在 生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物 质。、基本原理的分类 一)基本原理离心力( centrifugal force ，Fc)离心作用是根据在一定角度速度 下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力( Fc)的 大小等于离心加速度 2X与颗粒质量 m的乘积，即：其中 是旋转角速度，以弧度 / 秒为单位； X是

2、颗粒离开旋转中心的距 离，以 cm为单位； m是质量，以克为单位。相对离心力( relative centrifugal force， RCF)由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在 文献中常用“相对离心力”或“数字 g”表示离心力，只要 RCF值不变， 一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。式中 X 为离心转子的半径距离，以 cm为单位； g 为地球重力加速度 ( 980cm/sec2)； n 为转子每分钟的转数( rpm)。在上式的基础上， Dole 和 Cotzias 制作了与转子速度和半径相对应

3、的离 心力的转换列线图，见图 16-4 ，在用图 16-4 将离心机转数换成相对离心力 时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离 心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间 RCF标尺上的交叉点，即 为相应的离心力数值。 例已知离心机转数为 2500rpm，离心机的半径为 7.7cm， 将两点连接起来交于 RCF标尺，此交点 500g即是 RCF值。沉降系数( sedimentation coefficient， s)根据 1924 年 Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。若 用 2 n/60 表示，则式中 X1为离心前粒子离旋转

4、轴的距离； X2 为离心后粒子离旋转轴的距 离。S 实际上时常在 10-13 秒左右，故把沉降系数 10-13 秒称为一个 Svedberg单位，简写 S，量纲为秒。沉降速度( sedimentation velocity )沉降速度是指在强大离心力作 用下，单位时间内物质运动的距离。式中 r 为球形粒子半径； d为球形粒子直径； 为流体介质的粘度； P 为粒子的密度； m为介质的密度。从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密 度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉 降系数公式中，则 S 的表示式也可表示为：从该式中可看出，当 P m，则 S

5、0，粒子顺着离心方向沉降。 当 P m，则 S 0，粒子到达某一位置后达到平衡。当 Pm， 则 S m。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速 度的不同， 使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列 区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时 起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混 合。由于 P m可知 S 0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有 足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带， 又要控制在任一粒子达到沉 淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不 足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的

6、沉降，沉降受物质本身大小 的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液 有 Ficoll 、 Percoll 及蔗糖（三）等密度离心法等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度， 此种密度梯度液包 含了被分离样品中所有粒子的密度， 待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度 液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀 的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的 密度大于粒子的密度，即 mP 时粒子上浮；在弯顶处 Pm时，则 粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即 Pm，此时 dx/dt 为零粒子不再移动，粒子形成纯组份的区

7、带，与样品粒子的密度有关，而与 粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也 不能改变这些粒子的成带位置。此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是 CsCl。（四）梯度溶液的制备梯度材料的选择原则作为一种理想的梯度材料应具备以下几点： 与 被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。 可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低， 离子强度和 pH变化较小。不会对离心设备发生腐蚀作用。容易纯化， 价格便宜或容易回收。浓度便于测定，如具有折光率。对于超速离心分 析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这

8、些条件是理想条 件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合 上述原则的梯度材料：糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（ Ficoll ）、右旋糖酐、 糖原。无机盐类： CsCl（氯化铯）、 RbCl（氯化铷）、 NaCl、KBr 等。 有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide ）等。硅溶胶：如 Percoll 。 蛋白质：如牛血清白蛋白。重水。非水溶性有机物：如氟代碳等。梯度材料的应用范围蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高， 其最高密度可达 1.33g/ml ， 且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜

9、用于细胞的分离。聚蔗糖：商品名 Ficoll ，常采用 Ficoll-400 也就是相对分子重量为 400000，Ficoll 渗透压低， 但它的粘度却特别高， 为此常与泛影葡胺混合使 用以降低粘度。 主要用于分离各种细胞包括血细胞、 成纤维细胞、肿瘤细胞、 鼠肝细胞等。氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达 1.91g/ml 。由 于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于 DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。卤化盐类： KBr和NaCl可用于脂蛋白分离， KI和NaI可用于 RNA分 离，其分辨率高于铯盐。 NaCl 梯度也可用于分离脂蛋白， Na

10、I 梯度可分离天 然或变性的 DNA。Percoll ：是商品名，它是一种 SiO2 胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮 （PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻 融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性 pH和高离子强度下不稳定。它 可用于细胞、细胞器和病毒的分离。三、分析性超速离心与制备性超速离心不同的是： 分析性超速离心主要是为了研究生物大分 子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的 转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。（一）分析性超速离心的工作原理分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、 一套真空系统和一套光学 系统所

11、组成。该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置，此轴可 使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳二 个小室：分析室和配衡室。配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分析 室的平衡用。分析室的容量一般为 1ml，呈扇形排列在转子中，其工作原理 与一个普遍水平转子相同。分析室有上下二个平面的石英窗，离心机中装有 的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质， 可以通 过对紫外光的吸收 （如对蛋白质和 DNA）或折谢率的不同对沉降物进行监视。 后一方法的原理是：当光线通过一个具有不同密度区的透明液，在这些区带 的界面上产生光的折射。 在分析室中物质沉降时重粒

12、子和轻粒子之间形成的 界面就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一“峰”。由 于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以 得到物质沉降速度的指标。图 16-5 是分析性超速离心系统的示意图。（二）分析性超速离心的应用测定生物大分子的相对分子重量测定相对分子重量主要有三种方法： 沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中应用最广的是沉降速度，超速离 心在高速中进行， 这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射 地向外移动， 在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间 形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标，然后用照相记录，即可求出粒子的沉降系数分子或粒子的相对分子重量则可从 Svedberg 方程式来确定：图 16-5 分析性超速离心系统图示式中 M：该分子不含水的相对分子重量； R：气体常数； T：绝对温度； S： 分子的沉降系数； ：分子的微分比容（当一克溶质加到一个大体积的溶液 中所占有的体积）； ：溶剂的密度。生物大分子的纯度估计静分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均 质性的最常用方法之