响应面法对罗汉果花总黄酮超声波提取工艺的优化

1、响应面法对罗汉果花总黄酮超声波提取工艺的优化摘要：以罗汉果( Siraitia grosvenorii )花为原料，采 用超声波技术从罗汉果花中提取总黄酮，并利用响应面法设 计优化了工艺参数。通过对乙醇体积分数、液料比、超声波 功率、超声时间等因素进行试验分析，考查了各提取参数对 罗汉果花中总黄酮提取率的影响，并在单因素试验的基础上 进行响应面试验设计，确定了罗汉果花中总黄酮的最佳提取 工艺条件，即乙醇体积分数为 67.55%，超声时间 43.62 min， 超声波功率208.48 W,液料比15 : 1( mL : g),此条件下总黄酮提取率可达到 6.537%。关键词：罗汉果( Sirai

2、tia grosvenorii )花；超声波；总 黄酮；响应面中图分类号： TS209；S567.23+9 文献标识码： A 文章编 号：0439-8114(2016) 06-1518-05DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.06.039罗汉果花来源于葫芦科植物罗汉果( Siraitia grosvenorii ) 的干燥雄花，有清热解毒、化痰止咳、养声润肺的功效，常 用于治疗口臭、口腔炎、咽炎、扁桃体炎、色斑、肝斑、暗 疮等疾病 1 。罗汉果花虽然在民间是一种常见的花草茶，但 对于其功效成分的深入研究，直到近几年才开始逐渐展开。研究人员发现，罗汉果花中的精油

3、具有抗菌活性，尤其是对 枯草芽孢杆菌有很强的抑制作用 2 。另外，罗汉果花中还含 大量的黄酮类化合物，经分析主要为山奈酚 3 。黄酮类化合 物是一大类天然多酚化合物，其以游离态或糖苷形式广泛存 在于植物中，结构复杂多样，能防治心脑血管疾病和呼吸系 统疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、 抗肿瘤以及增强免疫能力等生理活性 4 ，5。黄酮的提取方 法主要有超临界萃取、热回流提取、酶提取、微波辅助提取 和超声波辅助提取等 6， 7。其中超声波辅助提取是利用超 声波产生的 “空穴作用” 破碎植物细胞， 使提取液不断振荡， 有利于黄酮类化合物的溶出和扩散，大大提高了植物有效成 分的提取率，

4、该方法操作简单，无需加热，对黄酮的活性破 坏少，且提取率高， 是现在应用非常广泛的一种黄酮提取法。 因此本研究采用超声波辅助提取罗汉果花中总黄酮，并应用 响应面分析法优化试验结果得出最佳提取条件，以期为罗汉 果花的开发应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 主要材料与试剂罗汉果花， 2013年 7月购于广西桂林永福县，烘箱中55 C烘4 h,粉碎机粉碎后置于试剂瓶中，室温贮藏于干燥 器中备用。无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂 （均为分析纯）购于南京化学试剂有限公司；芦丁（生化试 剂）购于美国 Sigma 公司。1.2 主要仪器与设备TU1810 紫外可见分光光度计， 北京普析通用仪器

5、有限公 司；LG10-2.4A高速离心机，北京医用离心机厂；WK-1000A高速药物粉碎机，青州市精诚机械有限公司；JY92-2D超声波细胞粉碎机， 宁波新芝生物科技股份有限公司； DHG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；FA2004A电子天平，上海精天电子仪器有限公司；RE-85Z旋转薄膜蒸发器，上海青浦泸西仪器厂； QUANTA2 00环境扫描电子显微镜， 荷兰FEI公司。1.3 方法1.3.1 标准曲线的绘制 8 精密称取干燥至恒重的芦丁 标准品20.0 mg置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，置 水浴锅中微热使之溶解，放冷后用60%乙醇定容至刻度，摇匀，得

6、质量浓度为 0.200 mg/mL 的标准溶液。量取芦丁标准 溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6 只 10 mL 比色管中， 各加30%乙醇溶液至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇 匀，静置6 min，再各加入10%Al（ NO3）3溶液0.3 mL，摇 匀，静置6 min，加1 mol/L的NaOH溶液4 mL，然后分别加 水定容至10 mL，摇匀，放置15 min。以空白试剂为参比液， 在 510 nm 下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，标准溶液质 量浓度（ mg/mL ）为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进 行回归，得吸光度 A 与总黄酮浓度 x

7、（ mg/mL ）的线性方程 为：A=11.675x+0.033 5, R2=0.997 8 表明总黄酮浓度在 0.02 0.1 mg/mL 范围内与吸光度呈线性关系。1.3.2罗汉果花中总黄酮的提取准确称取2.0 g罗汉果花粉置于150 mL锥形瓶中，按设定液料比加入某体积分数 的乙醇溶液，在一定功率条件下超声波破碎提取一段时间， 提取液以8 000 r/min离心分离10 min，上清液于100 mL容 量瓶中定容。1.3.3样品中总黄酮含量的测定取1 mL定容后的提取液，按“ 1.3.1 ”的方法测定样品的吸光度A,利用标准曲线回归方程得出样品溶液中总黄酮的质量浓度，再计算出样品 中总黄

8、酮的提取率。计算公式为：总黄酮提取率（以芦丁计）=100%式中，D为样品溶液稀释倍数；C为样品溶液中总黄酮 浓度，mg/mL ; V1为测定时比色管中溶液体积，mL; V2为样品溶液总体积， mL； m 为样品质量， mg。1.3.4 单因素试验 以总黄酮提取率为检测指标，分别考 察提取方法、乙醇体积分数、超声波功率、液料比（mL ： g, 下同）、超声时间 5 个因素对总黄酮提取率的影响。1.3.5 Box-Behnken 试验设计 在单因素试验的基础上, 选 取液料比、乙醇体积分数、超声时间和超声波功率为试验因 素,利用 Design-expert 软件进行 Box-Behnken 试验设

9、计 9 , 优化罗汉果花中总黄酮的提取工艺。1.4 数据统计方法所有试验均做3次平行，取平均值，利用Excel程序或Design-expert 软件对结果进行分析。2 结果与分析2.1 单因素试验结果2.1.1 提取方法对罗汉果花中总黄酮提取率的影响 分别考察了回流提取法、酶提取法、超声波提取法 3 种方法对 罗汉果花中总黄酮提取率的影响，并将提取后的物料在室温 条件下风干，置于载物台上用离子溅射仪喷金后在扫描电子 显微镜下观察其形貌变化， 结果见表 1 和图 1。由表 1 可知， 超声波提取法的总黄酮提取率最高，酶提取法次之，而回流 提取法的提取率最低。从图1 (a)也可以看出，经回流提取后

10、的物料其内部结构完整密实，说明大部分植物细胞未受到 破坏，因而细胞内组分亦不能充分浸出，提取率最低；而图1( c)中超声波提取后的物料面变得平滑松散，说明提取过 程中物料在超声波的空化作用下，引起体系的宏观湍动和固 体颗粒的高速碰撞，传质边界层变薄，植物组织细胞发生了 破壁或变形，使得细胞内组分更易浸出，提取率最高。因此 选择超声波提取法从罗汉果花中提取总黄酮。2.1.2 乙醇体积分数对罗汉果花中总黄酮提取率的影响按液料比10 : 1,超声波功率150 W，超声时间30 min，分 别考察不同乙醇体积分数对罗汉果花中总黄酮提取率的影响，试验结果如图2 (a)所示。黄酮是一大类极性范围很广 的化

11、合物，既包括水溶性的，又包括醇溶性的。而不同体积 分数的乙醇溶液，极性不同，对目标组分的溶解能力亦不相 同。从图2( a)可以看出，随着乙醇体积分数的逐渐增大， 罗汉果花中总黄酮的提取率先升高后降低，在乙醇体积分数 为 70%时，总黄酮的提取率达到最大值。这说明70%乙醇的极性与罗汉果花中黄酮类化合物的极性相似，醇溶性和水溶 性的黄酮类物质都能最大程度的溶出，而当乙醇体积分数超 过 70%时，水溶性黄酮溶出量减少，同时一些脂溶性物质、 糖类及黏性物质的大量析出，又会影响醇溶性黄酮的溶出， 故总黄酮提取率迅速降低。因此，确定罗汉果花中总黄酮提 取较佳的乙醇体积分数为 70%。2.1.3 超声波功

12、率对罗汉果花中总黄酮提取率的影响用70%乙醇为提取溶剂，按液料比10 ： 1,超声时间30 min , 分别考察不同超声波功率对罗汉果花中总黄酮提取率的影 响，试验结果如图2 (b)所示。超声波的空化现象可以强化 溶质扩散，且对原料具有破碎作用，使得原料组织内的化学 成分能与溶剂充分接触，进而提高化学成分的提取效率。由 图2 (b)可知，当超声波功率小于 200 W时，总黄酮提取率 随着功率的增加而增大， 且在超声波功率为 200 W时达到峰 值，但 200 W 以后，由超声波产生的热效应使得一些黄酮发 生了氧化，氧化损失超过了提取效应带来的增加，而且功率过高，杂质溶出增加，也会阻碍黄酮类化合

13、物的溶出，从而 导致总黄酮提取率随着功率的增加开始下降。因此，确定罗 汉果花中总黄酮提取较佳的超声波功率为200 W 。2.1.4 液料比对罗汉果花中总黄酮提取率的影响 用 70% 乙醇为提取溶剂，按超声波功率200 W，超声时间30 min ,分别考察不同液料比对罗汉果花中总黄酮提取率的影响，试 验结果如图2 (c)所示。随着提取溶剂的增加，原料与溶剂 的接触面积增大，而且原料与溶剂间的浓度梯度也会增大， 从而有利于黄酮类物质的浸出。由图2(c)可以看出，随着液料比的增加，总黄酮的提取率逐渐增大。 当液料比从10 : 1升高至15 : 1时，总黄酮提取率急剧增加，但当液料比超 过 15: 1

14、 后，提取率的增加趋势趋于缓和，这主要是因为当 溶剂量达到一定程度后，溶剂将原料充分包裹，此时再继续 增加溶剂量对提高总黄酮提取率已没有显著的影响。因此， 从节约溶剂和减少后期浓缩工作量角度考虑，确定溶剂与罗 汉果花的比例为 15: 1 比较适宜。2.1.5 超声时间对罗汉果花中总黄酮提取率的影响 用 70%乙醇为提取溶剂，按液料比 15: 1，超声波功率 200 W， 分别考察不同超声时间对罗汉果花中总黄酮提取率的影响， 试验结果如图2 (d)所示。由图2 (d)可以看出，随着超 声时间的延长，黄酮类物质通过超声波的空化效应从罗汉果 花中大量溶出， 提取率急剧增加， 并在 40 min 时达

15、到最大值， 而 40 min 之后随着超声时间的继续延长， 黄酮类物质溶出量 开始减少，但超声波空化作用带来的高温热效应却逐渐增强， 使得一部分溶出的黄酮类物质氧化分解，造成总黄酮提取率 迅速下降。因此，确定罗汉果花中总黄酮提取适宜的超声时 间为 40 min 。2.2 Box-Behnken 试验设计结果Box-Behnken 试验因素与水平见表 2，试验设计编排方案 及结果见表 3。利用 Design-Expert 7.0.0软件对表 3 中的试验 数据进行方差分析（表 4）。以总黄酮提取率为响应值，各因 素经二次回归拟合后，得到罗汉果花中总黄酮提取率（Y）对液料比（A）、乙醇体积分数（B

16、）、超声时间（C）和超声 波功率（D）的二次多项回归方程为：Y=6.57+0.060A-0.30B+0.32C+0.18D-0.065AB-0.20AC+0.13AD+0.060BC+0.30BD+0.29CD-0.45A2-0.46B2-0.48C2-0.62D2 由表 4 可知，回归模型检验的P0.05，表现为不显著，说明方程模拟的比较好；该模型的 R2=0.945 8，说明该模型充分拟合试 验数据， 试验误差小， 预测值与实测值之间具有高度相关性。 离散系数表示试验的精确度，其值越低，试验结果的可靠性 越高 10。本试验离散系数为 3.15%，在可接受范围内，说明试验结果真实可靠。信噪比

17、为 14.28，远大于 4，说明该模型 拟合度和可信度均较高。综上所述，该方程是罗汉果花中总 黄酮提取率与提取工艺各参数间合适的数学模型，利用此回 归方程可确定罗汉果花中总黄酮的最佳提取工艺。回归方程中一次项系数绝对值的大小反映了各因素对 响应值的影响程度 11 。由回归方程可知，影响罗汉果花中 总黄酮提取率的主次因素为：超声时间乙醇体积分数 超声波功率 液料比，其中提取时间、乙醇体积分数、超声波功 率的作用达到极显著，在二次项中， 4 个因素都表现为极显 著，在交互相中，乙醇体积分数与超声波功率的交互作用和 超声时间与超声波功率的交互作用表现为极显著水平，其三 维响应曲面及等高线见图 3 和

18、图 4。等高线的形状可反映交 互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用强，而圆形则与 之相反12 。由图 3、图 4 可知，乙醇体积分数与超声波功率、 超声时间与超声波功率的交互作用对罗汉果花中总黄酮的 提取率影响皆显著，且在所选范围内两组图都存在极值点， 即响应面的最高点，极值点所对应的条件位于等高线中心点 处。 响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三 维空间的曲面图，从图上可形象地看出各因素交互作用对罗 汉果花中总黄酮提取率的影响，若曲线越陡峭，则表明该因 素对总黄酮提取率的影响越大 12。图3表示液料比15 : 1, 超声时间 40 min 时，乙醇体积分数和超声波功率对总黄酮提 取的影

19、响。从图 3可以看出，随着乙醇体积分数和超波声功 率的增加，总黄酮提取率先升高后降低，且乙醇体积分数曲 面斜率大于超声波功率曲面斜率，说明乙醇体积分数对罗汉 果花中总黄酮提取率的影响大于超声波功率；图 4 表示液料 比15 ： 1,乙醇体积分数 70%时，超声时间和超声波功率对 总黄酮提取的影响。从图 4 可以看出，随着超声时间与超声 波功率的增加，总黄酮提取率先升高后降低，超声时间和超 声波功率的曲面变化都很陡峭，但沿提取时间轴向等高线变 化密集，说明提取时间对总黄酮提取率的影响大于超声波功 率。通过响应面得出的最佳提取工艺条件为液料比 15： 1， 乙醇体积分数 67.55%,超声时间43

20、.62 min，超声波功率 208.48 W。按此最佳工艺条件进行 3次验证试验，得总黄酮 平均提取率为 6.537%,与回归方程得到的预测值 6.683%相 差 0.146%,实际值与预测基本吻合。3 结论 采用超声波提取法从罗汉果花中提取总黄酮,通过单因 素试验分析,考察了不同因素对罗汉果花中总黄酮提取率的 影响,确定总黄酮提取时较适宜的乙醇体积分数为 70%,超 声波功率为200 W，最适液料比为15 ： 1,提取时间为40 min ; 通过 Box-Behnken 试验设计和分析,确定了罗汉果花中总黄 酮超声波提取的最佳工艺条件为：液料比 15： 1,乙醇体积 分数67.55%,超声时

21、间43.62 min，超声波功率 208.48 W, 在此条件下, 测得罗汉果花中总黄酮的提取率可达到 6.537%参考文献：1 陈全斌， 朱 静，谭洪盛 .罗汉果花中黄酮苷元鉴定 J. 安徽农业科学， 2011， 39(2)： 792-794.2 邓 双，梁志远， 张丽丽， 等 .三种花精油抗菌活性初 探J.贵州师范学院学报，2012, 28 (12): 30-33.3 谭洪盛，马俊飞，陈全斌 .罗汉果花中槲皮素和山奈 酚含量的测定J.广西科学，2012, 19 (1): 69-70, 73.4 BUBOLS G B， VIANNA D R， ALEXANDER M R， et al. Th

22、e antioxidant activity of coumarins and flavonoidsJ. Mini Reviews in Medicinal Chemistry ， 2013， 13( 3): 318-334.5 SIASOS G， TOUSOULIS D， TSIGKOU V， et al. Flavonoids in atherosclerosis : An overview of their mechanisms of actionJ.Current Medicinal Chemistry ， 2013， 20(21): 2641-2660.6 LU J， ZHOU C， RONG O， et al.Optimization of microwave-assisted extraction of flavonoids from cryptotaenia japonica kassk using response surface methodologyJ.Advance Journal of Food Science and Technology， 2013， 5( 3): 310-317.7 SHAN B， XIE J H， ZHU J H， et