20121204检验科微生物室模版最好

1、临床微生物质量控制临床微生物质量控制 湖南省肿瘤医院检验科湖南省肿瘤医院检验科 黄宏君黄宏君 号码：号码：1397484423313974844233 Email:hhj7893680163 Email:hhj7893680163 博爱 敬业 求真 务实 内内 容容 博爱 敬业 求真 务实 l 人类面临着微生物的挑战，要打赢这场战争不仅需要有经 验的医生，还需要一支优秀的临床微生物检验队伍。 l 与过去的10年或20年相比，临床微生物实验室的规模和发 展速度已经发生了巨大的变化。目前，我们离CLSI(临床 实验室标准化研究所)标准化文件要求还相差很远，我们 应进行规范操作，才可能应对微生物向人

2、类的挑战，才能 适应临床的需要。 l 临床微生物检验，在感染性疾病及相关病患的诊断治疗预 防及研究工作中起着越来越重要的作用，为了保障检验结 果的准确性和可靠性，日常工作中要注意开展质量控制。 博爱 敬业 求真 务实 临床微生物检验的目的和意义 l 提供感染性疾病诊断的病原学依据 l 为医院感染流行病学调查提供依据 l 为感染性疾病治疗提供用药依据 l 细菌耐药性监测需要 l 为合理使用抗菌药物提供依据 l 为生物安全、医院感染管理和监控预防提供科学依据 博爱 敬业 求真 务实 分析后 质量控制范畴质量控制范畴 分析前 分析中 质量保持持续改进 博爱 敬业 求真 务实 临床微生物检验质量控制的

3、有关概念 为了保证质量控制，我们需注意： u 标本的质量（数量、体积、可接受的合格标本、运送方式 等） u 试验方法的有效性（根据临床症状、诊断和其他临床资料 ，采用适当检测方法） u 试验的操作方法和步骤、试剂、培养基、仪器、环境、人 员等。 1. 有临床意义的结果报告（报告的准确、清楚、及时和完整 ） 博爱 敬业 求真 务实 临床微生物质量控制的依据标准 卫生部医政司颁布的全国临床检验操作规程，美国临 床实验标准化委员会（CLSI）主要颁布的最新的质量控制 和评议方案。 检验方法学、操作手册应不断更新，开展循诊医学，不断 淘汰无价值的试验，增加新的有临床价值的试验。 博爱 敬业 求真 务实

4、 u临床微生物制度 u制定程序性文件（可参考ISO 15189认可准则中应用说明 要求） uSOP操作手册 u仪器的性能验证等 博爱 敬业 求真 务实 临床微生物临床微生物 实验室的基实验室的基 本装备本装备 孵育箱、 CO2培养箱 、高压器 生物安全柜或安全罩 试剂、染液、质 控菌株、培养基 冰箱、酒精灯、 接种环、游标卡 尺、温度计等 光学显微镜 博爱 敬业 求真 务实 u室内质控 室内质控内容包括对各种实验条件及实验过程进行监督 监督的对象有仪器设备、培养基、鉴定系统及操作全过程 u室间质量评价 博爱 敬业 求真 务实 临床微生物 室需建立室 内质控 1 1 2 3 4 常规试验室内质控

5、 培养基质控 药敏试验的质控 自动化设备质控：鉴定和药敏、血培养 系统 博爱 敬业 求真 务实 ATCC：美国典型菌株保存中心：美国典型菌株保存中心-主要来主要来 源源 NCTC：英国国家典型菌株保存中：英国国家典型菌株保存中 实验中用标准方法鉴定，鉴定值实验中用标准方法鉴定，鉴定值 95典型菌株，并经多次传代，典型菌株，并经多次传代， 特征衡定的菌株特征衡定的菌株 质控质控 菌株菌株 参考参考 菌株菌株 临床分临床分 离菌离菌 博爱 敬业 求真 务实 质控必备菌株 细菌名称 菌号 用途 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 纸片扩散质控 金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 MIC测定质控

6、大肠杆菌 ATCC 25922 纸片和MIC 绿脓假单胞菌 ATCC 27853 纸片和MIC 粪肠球菌 ATCC 29212 胸腺嘧啶含量测定 淋病奈瑟菌 ATCC 49226 淋球菌药敏 流感嗜血杆菌 ATCC 49247 嗜血杆菌药敏 肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 ESBL阳性菌 博爱 敬业 求真 务实 低温速冻低温速冻 苛养细菌苛养细菌 冷冻干燥冷冻干燥 长期保留菌株长期保留菌株 参考菌株参考菌株 保存方法保存方法 高层琼脂高层琼脂 非苛养菌非苛养菌 琼脂斜面琼脂斜面 现用菌株现用菌株 博爱 敬业 求真 务实 室间质评样本的检测操作程序 1. 测试环境、仪器、试剂的要求 室温：

7、2025 湿度：10个上皮细胞/LP、5个/HP，未经抗菌 药物治疗的持续性腹泻患者粪便 伤口标本：如出现上皮细胞，提示标本已受皮肤菌群的污 染，高倍视野中超过5个鳞状上皮细胞的伤口标本不适合 做厌氧培养 博爱 敬业 求真 务实 血液细菌培养血液细菌培养 临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血流感染的患者，需做血液细 菌培养以明确病原。及时、准确地从患者血液中分离出病原菌，才 能正确实施有效地抗菌治疗，从而有助于提高治愈率和降低医疗费 用。 1. 1.采血时机采血时机应在用抗菌素治疗前, 最好在患者发冷发热前半小时采血为 宜。 2.2.采血次数与间隔采血次数与间隔 u 急性感染患者：急性感染患者：

8、从两臂分别采2份血样（两套）。 u 感染性心内膜炎患者：感染性心内膜炎患者：24h内采血3次, 每次间隔不少于30分钟。 u 发热原因不明患者：发热原因不明患者：2448h后可再采血2次,间隔不少于60分钟。 博爱 敬业 求真 务实 呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养 u标本留取质量的好坏直接影响到对下呼吸道病原 学的诊断 u标本的采集要尽量减少上呼吸道正常菌群干扰 u应在用药前或停药1天后留取标本。 博爱 敬业 求真 务实 痰痰 采集方法采集方法 自然咳痰：必须用清水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于 灭菌容器中或输送培养基中；支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议 直接种入输送培

9、养基 处处 理理 痰首先用灭菌生理盐水将痰液洗3次，然后将痰块打碎，或加入等量 10g/L的胰蛋白酶将痰块消化后再接种。 合格标本合格标本 外观为脓痰、粘液、血，涂片镜检25个 WBC/LP 为合格标本。 博爱 敬业 求真 务实 泌尿道标本细菌培养泌尿道标本细菌培养 u 应在用药前或停药5天后留取标本, 并使尿液在膀胱内停留68h以上。 u 尽量避免或减少尿道口正常菌群干扰。 u 清洁中段尿、导尿导管尿、经耻骨上皮肤穿刺采集膀胱内尿液，送检标本 以晨起第一次尿液为佳 u 尿量不宜太多，试管塞子与尿液不应直接接触 u 留取导尿管尿要排空导尿管内陈旧尿液，倘留置尿管超过三天应避免采用 。 u 标本

10、采集后立即送检，不能立即送检者，可暂存4冰箱，但保存不超过 8h 博爱 敬业 求真 务实 粪便标本的培养 u 应在发病早期并且尽量在用抗生素治疗前采集，稀便不少于1ml，固体便不少 于1克，无便患者可用直肠拭子采集标本。 u 要挑取含脓、黏液、血等病理改变或水样粪便送检。直肠拭子采样量要足够 ，拭子上肉眼应可见粪便。 u 注意事项： 虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。 厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。 注意挑取脓血便或粘液便做培养 要进行分区划线。如图所示。 博爱 敬业 求真 务实 分泌物的培养 1. 对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术

11、后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性 病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭 菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送检。 2. 闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等 ，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集， 应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送 检应应用输送培养基。 博爱 敬业 求真 务实 脓液标本 要尽量避免病灶表面细菌污染。开放性脓肿，采样前无 菌盐水冲洗伤口，拭去表面污染脓液，挑取病灶深部脓液； 封闭性脓液，严格病灶皮肤或黏膜表面的消毒后用无菌干燥 注射器穿刺抽

12、取，置无菌试管内送检，或切开排脓时用无菌 拭子采集深部脓液。 博爱 敬业 求真 务实 厌氧菌和伤口标本 厌氧菌标本 隔绝空气-氧对厌氧菌有毒性作用 液状标本应用注射器抽取密封送检 分泌物标本最好床边采集床边接种；另置厌氧环境送检（ 输送培养基） 伤口标本 在伤口切开排脓时留取标本 不能在伤口消毒清洗后留取标本 尽量采集伤口深部的脓汁送检 博爱 敬业 求真 务实 脑脊液标本 直接观察：革兰染色、抗酸染色、印度墨汁染色 无菌采集技术：避免标本污染及患者被感染 病毒培养标本：置4 保存 分枝杆菌培养标本：2mL以上，置4 保存 细菌培养标本置35 保存 博爱 敬业 求真 务实 微生物试验分析中质量控

13、制微生物试验分析中质量控制 种类和环节多（细菌鉴定、药敏、培养基、生化 管、仪器、稀释液） 涉及知识面广 复杂性高 需要强烈的责任感 博爱 敬业 求真 务实 常规试验的质量控制-天天做（质控菌株） 触酶试验：3H2O2每三天更换一次 血浆凝固酶试验：人血浆或商品乳胶试剂 氧化酶试验：1盐酸四甲基对苯胺水溶液浸泡厚滤纸， 室温吹干压成小纸片，置含干燥剂容器20保存，或买 商品制剂 内酰胺酶：头孢硝噻吩(Nitrocefin)为底物，适于测 试嗜血杆菌、淋球菌、卡他莫拉菌、肠球菌 革兰染色：革兰阳性菌染成红色；革兰阴性菌染成紫色； 另涂片厚度、染色和脱色时间、染料沉渣等也影响染色质 量 博爱 敬业

14、 求真 务实 培养基的质量控制 u 一般性状：外观：透明、清亮、无混浊、无沉淀，颜色符合要求，表面 湿润但无水汽、平整、光洁无凹坑和气泡。整块平板厚薄均匀。厚度： 一般厚度在3mm，但MH平板厚度4mm。斜面的长度试管长度的2/3 。pH是细菌生长的重要条件之一，合格培养基的pH应在规定值上下0.2 的范围内。 u 无菌试验：新制备或新买的培养基在使用前要随机抽取一定数量的样品作 无菌试验。 购买的培养基要有质量保证如合格证明等文件；若无质量保 证需检测相应的性能。 博爱 敬业 求真 务实 培养基的质量控制 u 细菌生长试验：所有的培养基在使用前还必须做细菌生长试验以测定 培养基性能是否符合要

15、求。标准菌株分2种：一种是已知的可在某种 培养基上生长并产生典型生物学性状的，对培养基中的某种物质产生 阳性反应的菌株；另一种是用已知的不能在某种培养基上生长或对培 养基中的某种物质产生阴性生化反应的菌株。如血琼脂平板：乙型溶 血性链球菌生长， 溶血；甲型链球菌，a溶血；巧克力琼脂平板： 流感嗜血杆菌生长良好；中国蓝琼脂平板和SS琼脂平板：革兰阴性菌 生长，革兰阳性菌不生长。 博爱 敬业 求真 务实 试剂质控 临床微生物实验室常用的试剂包括染色液、诊断血清以及各种生化反应试剂等。 染色液及染色方法质量控制：购买的或配置的染色液，每次需做好相关的记录，如操 作者和开瓶日期等；还要进行染色步骤质控

16、，如革兰染色在一张玻片上同时涂有 金葡菌和大肠杆菌，以保证染色性判断准确无误。 常用生化试剂的质控：随着细菌鉴定仪和快速微量生化鉴定板条的普及，临床微生物 检验常用的生化试剂种类日趋减少，应注意在用试剂在贮存时的避光、冷藏等要 求，保证试剂的稳定性。不要使用过期的试剂。 诊断血清的质控：诊断血清是一种重要的细菌鉴定试剂，应从有资质的生产单位购买 。验收时必须看清生产批号、血清效价、透明度与色泽。试验中应注意无菌操作 ，避免细菌污染。要经常检查贮存在4冰箱中的各种血清，若发现混浊，出现絮 状，应停止使用。为保证血清凝集反应结果准确，应每3个月对血清进行一次质控 。不要使用过期的血清。 博爱 敬业

17、 求真 务实 纸片药敏试验的室内质控 基础质控：连续做30天，如失控超过3次还需继续，如失控低于3次 可改为每周1次 纠控：每周质控中发生失控应纠控，方法：连续5天，每天1次，每次 重复5个纸片，如找到明确失控原因，可立即改为每周1次，否者继续 4冰箱保存一周的用量 药物敏感试验是临床微生物检验的重要步骤之一，其结果正确与否涉 及治疗效果的好坏。 博爱 敬业 求真 务实 仪器的质量控制 按仪器说明规定用标准菌株定期对不同批号的试剂进行 质控 对冰箱、二氧化碳孵箱、普通孵箱、水浴箱等基本设备 的每日温度、气体浓度的监控记录；显微镜、细菌鉴定 仪等仪器的使用、保养、维修记录。以保障实验室各种 设备

18、、仪器的正常运转。 对仪器进行性能验证，若有两台以上的仪器则要进行仪 器比对 博爱 敬业 求真 务实 细菌鉴定的基本步骤 标本的分离培养（这关系到整个结果的可靠性） 培养结果的观察（致病菌的选择） 细菌的分纯、鉴定（天地人鉴定系统、ATB半自动微生物 鉴定、VITEK系统、MicroScan自动微生物分析系统、 Sensititre 全自动微生物鉴定系统，我们肿瘤医院用的 是前两种鉴定系统） 博爱 敬业 求真 务实 常用的培养基种类和用途 血平板普通细菌用 巧克力平板含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球 菌和淋球菌用 中国蓝/麦康凯平板G-杆菌用 SS平板沙门氏菌和志贺氏菌用 M-H平板细

19、菌药敏用 TCBS平板弧菌科细菌用 真菌显色平板真菌培养用 罗氏培养基分枝杆菌用 博爱 敬业 求真 务实 常见标本细菌培养基选择 痰-血平板、巧克力平板、（中国蓝/麦康凯）放CO2环境，能分离肺炎链球菌 、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌 尿-血平板、（中国蓝/麦康凯）定量培养 粪便-中国蓝/麦康凯平板、SS平板等能分离沙门菌、志贺菌等，报告“未检 出XXX菌” 脑脊液-血平板、巧克力平板CO2环境，能分离常见苛养菌（脑膜炎奈瑟菌、 流感嗜血杆菌、单核细胞李斯特菌等），常规进行革兰染色、墨汁染色 胸腹水：血平板、巧克力、肉汤 胃液、胆汁：血平板、中国兰、肉汤 真菌培养：沙氏培养基 厌氧培养：厌氧血平板

20、、中国兰、肉汤、涂片 阴拭子、脓、分泌物：血平板、中国兰、肉汤 咽、眼、耳拭子：血平板、巧克力平板、中国兰、肉汤； TB培养：罗氏鸡蛋培养 注：血平板和巧克力平板放置CO2培养箱或烛缸培养，其它放置普通培养环境 博爱 敬业 求真 务实 培养结果的观察（致病菌的选择） 观察培养基上是否有细菌生长 观察生长情况（是单一种细菌还是多种细菌） 观察生长的细菌是否具有某些典型特征 排除污染细菌 对于无菌部位所采集的标本（CSF、胸水、腹水、关节液 、血液、骨髓、各器官穿刺液等等），只要培养出细菌（ 排除污染）一律都视为致病菌。 对于有菌部位或易被正常菌群污染的标本，培养出细菌后 ，要根据标本的不同，排除

21、正常菌群后，再挑选致病菌（ 请看下图）。 博爱 敬业 求真 务实 无无 菌菌 部部 位位 标标 本本 博爱 敬业 求真 务实 涂片染色 涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。 1 革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描 述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，呈葡萄状排列 ；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。 2.抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结 果，报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌 +；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本；不能报告找到结核 杆菌但可报告未找到结核杆菌。 博爱 敬业

22、 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 细菌鉴定 博爱 敬业 求真 务实 血清学试验 肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确 认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。 1.志贺氏菌多价和单价凝集血清： 2.沙门氏菌多价和单价凝集血清 3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清 4. 耶尔森氏菌凝集血清 博爱 敬业 求真 务实 真菌鉴定 1每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见 到真菌菌丝；从形态辨别常见丝状真菌;区别曲菌或毛霉菌。 2开展酵母样真菌分离培养，应具备最基本的沙氏培养基或用显色培养 基，鉴别白念和非白念，隐球菌等。 3.有条件的实验室应开展非培养的鉴定

23、方法，如-D葡聚糖的检测。 博爱 敬业 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 抗菌药物敏感性试验-常用方法 扩散试验diffusion test：纸片扩散法(抑菌圈直径) 稀释试验dilution test：肉汤稀释法、琼脂稀释法、最小抑 菌浓度minimum inhibitory concentration，MIC E试验E-test 自动化仪器检测 博爱 敬业 求真 务实 纸片扩散法操作步骤纸片扩散法操作步骤 制备接种物（制备接种物（0.5麦氏单位麦氏单位） M-H琼脂平板

24、上（琼脂平板上（15分钟内接种，涂抹均匀分钟内接种，涂抹均匀） 在接种好的琼脂平板上贴加纸片在接种好的琼脂平板上贴加纸片 孵育（孵育（15分钟内反转平板，分钟内反转平板，35C空气孵育空气孵育） 苛养菌苛养菌5CO2孵育孵育 判度结果和解释结果判度结果和解释结果 博爱 敬业 求真 务实 纸片扩散法判读结果纸片扩散法判读结果 将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最接近的整数毫米数。平 板应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用反射光照明。 如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从 上表面测量抑菌圈。 如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分 别观察苯唑西

25、林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古 霉素菌落的微弱生长，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC法确 变形杆菌(迁移生长)以及磺胺类药物的纸片法药敏忽略薄纱样蔓延生 长，微弱生长（20%或更少），克林霉素对葡萄球菌的抑菌圈内如有薄 雾状菌苔应报告细菌对克林霉素耐药,不管其是否显示“D”抑菌圈 博爱 敬业 求真 务实 博爱 敬业 求真 务实 药敏结果结果的审核 n S-敏感（Susceptible）：用常规用量治疗有效，常规用药 时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。 n R-耐药（Resistance）：用常规用量治疗不能抑制细菌的 生长，MIC高于药物在血、体液中可能达到的

26、浓度。 n I-中介 (Intermediate)：MIC接近血、体液中药物的浓度， 治疗反应率低于敏感株，药物生理浓集部位有效(泌尿道) ，加大用药剂量可能有效。 博爱 敬业 求真 务实 ESBL初步筛选实验 头孢泊肟 10ug or 头孢他啶 30ug 氨曲南 30ug or 头孢噻肟 30ug 头孢曲松 30ug 药敏纸片 头孢泊肟抑菌圈 =17mm* 头孢他啶抑菌圈 =22mm 氨曲南抑菌圈 = 27mm 头孢噻肟抑菌圈 =27mm 头孢曲松抑菌圈 127Cefotaxime NANAAztreonam 122Ceftazidime 1*22*Cefpodoxime 稀释法 (g/ml

27、) 纸片扩散法 (mm) Drug 博爱 敬业 求真 务实 可诱导的克林可诱导的克林 霉素耐药霉素耐药 (erm-介导介导) 常规常规D试验试验: 阳性阳性 15 g 红霉素红霉素 纸片及纸片及 2 g克克 林霉素之间距林霉素之间距 离为离为15-26. “D Test” 阳性反应阳性反应 博爱 敬业 求真 务实 常见细菌的耐药问题 肺炎链球菌PRSP 肠球菌、VRE 葡萄球菌MRSA、VRSA 肠杆菌属AmpC 超级细菌NDM-1（型新德里金属内酰胺酶 ） 以上的耐药问题都为目前全球最关注的细菌耐药问题，也 是我们在工作中要特别注意的问题 博爱 敬业 求真 务实 质量控制的规范化 为了保证微

28、生物实验室的质量，我们应做到质量控制的规范化 1药物敏感试验的质量控制：应包括30天的初始质量稳定测试；每周一 次的常规质量控制；5天的纠控程序。 2鉴定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；更换生产厂家；结 果发生异常等情况时均应进行质量控制。 3染色液质量控制：每天临床标本染色前应包括染色结果阳性和阴性的 对照物及染色液污染的质量检查。 4分离培养基：如血琼脂和巧克力，用肺炎链球菌、B-溶血和草绿色溶 血的链球菌、流感嗜血杆菌、等苛养细菌的标准菌株或经标准化试剂 已证实结果正确的菌株进行测试，判断其分离能力。 博爱 敬业 求真 务实 质量控制的规范化 5.培养箱温度的质量控制：每天第一个

29、开箱和最后离开实验室均应对培 养箱的温度作记录；CO2培养箱还应记录CO2的含量。 6冰箱温度记录：按每一冰箱存放的物品不同设置不同的质控范围，特 别对低温冰箱；每天记录一次。 7自动化设备：按厂家提供的SOP文件进行质控；在设备软件升级或修 改版本时均应进行质量控制程序。 8.每一有权向临床发报告的实验室都应参加全国或省或市级质量控制活 动。 博爱 敬业 求真 务实 临床微生物实验室报告制度的规范 临床微生物实验室应对不同的细菌检验报告时间和内容应有相应的 规定，并告诉临床各科，依此可防止不明原因的报告延迟。 应分两种报告形式： 危重感染报告: 常规报告: 博爱 敬业 求真 务实 报告的规范化 1.涂片报告 革兰染色：危重报告3060分钟报告。报告内容应包括染色反应、是细 菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。 抗酸染色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号表示。常规报告24h, 危重报告1h2。 2.血液和无菌体液培养的报告制度 实行三级报告制度： 第一级：培养液直接涂片结果； 第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果； 第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。 博爱 敬业 求真 务实 报告的规范化 3.便培养 24小时可发出初始报告; 72