实验四new、细胞培养用液的配制

1、6/29/2021细胞生物学实验 张伟 实验四实验四 、细胞培养使用液的配制、细胞培养使用液的配制 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 一、实验原理：细胞培养的营养条件一、实验原理：细胞培养的营养条件 体外培养细胞所需营养物质与体内基本相同，体外培养细胞所需营养物质与体内基本相同， 但需求的量与代谢方式与体内细胞不尽相同但需求的量与代谢方式与体内细胞不尽相同 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 1. 1. 细胞培养所需基本物质细胞培养所需基本物质 （1 1）水）水 （2 2） 无机盐无机盐 （3 3） 糖类糖类 （4 4） 氨基酸氨基酸 （5 5） 维生素维生素 （6 6） 促生长因子

2、促生长因子 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 糖类糖类-葡萄糖葡萄糖 细胞的主要营养物质，为生命活动提供能细胞的主要营养物质，为生命活动提供能 量。量。 与蛋白质和脂类共同构成结构材料和生物与蛋白质和脂类共同构成结构材料和生物 活性物质。活性物质。 体外培养动物细胞时，常以葡萄糖作为能体外培养动物细胞时，常以葡萄糖作为能 源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡 萄糖浓度有所不同。萄糖浓度有所不同。 植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 氨基酸氨基酸 常需要以下常需要以下121

3、2种氨基酸：种氨基酸：精氨酸、胱氨精氨酸、胱氨 酸酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、 苏氨酸、色氨酸、组氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸酪氨酸、苯丙氨苯丙氨 酸酸和和缬氨酸缬氨酸 另外所有细胞都需要另外所有细胞都需要谷氨酰胺谷氨酰胺，其具有，其具有 特殊作用特殊作用促进氨基酸进入细胞膜，参与核促进氨基酸进入细胞膜，参与核 酸合成，也是能源和碳源。酸合成，也是能源和碳源。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 2. 2. 培养用液培养用液 培养用液包括：培养液（基）、缓冲液、培养用液包括：培养液（基）、缓冲液、 平衡盐溶液、血清及消化液、平衡盐溶液、血

4、清及消化液、pHpH调节液和抗调节液和抗 生素等。生素等。 （1 1）水与平衡盐溶液水与平衡盐溶液 体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的 纯度要求较高。最低质量要求为电阻率在纯度要求较高。最低质量要求为电阻率在 1X101X106 6.cm.cm以上。以上。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 常用的平衡盐溶液有常用的平衡盐溶液有Hanks BSSHanks BSS，Earle BSSEarle BSS 等等 注意注意：一些一些BSSBSS含有含有CaCa2+ 2+、 、Mg Mg 2+ 2+ ，它们是细 ，它们是细 胞膜的重要组成成分，又参与许多细胞功

5、能胞膜的重要组成成分，又参与许多细胞功能 活动，但它们有使细胞凝集的作用，在配制活动，但它们有使细胞凝集的作用，在配制 分散细胞的消化液和特殊用途的细胞洗涤时，分散细胞的消化液和特殊用途的细胞洗涤时， 宜采用无宜采用无CaCa2+ 2+、 、Mg Mg 2+ 2+ 的 的D-Hanks D-Hanks 液或液或PBSPBS。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 （2 2）培养基）培养基 培养基是维持体外细胞生存和生长的溶培养基是维持体外细胞生存和生长的溶 液，分天然培养基和合成培养基。液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基天然培养基 常用的天然培养基有血清、血浆、水解常用的天然培养基有

6、血清、血浆、水解 乳蛋白和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）、乳蛋白和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）、 鼠尾胶原等。鼠尾胶原等。 优点：优点： 营养成分丰富，培养效果好营养成分丰富，培养效果好 缺点：缺点： 来源受限。来源受限。 成分复杂。成分复杂。 易发生支原体污染易发生支原体污染 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 血浆血浆: :鸡血浆的使用较早，含有多种化学物质，其中含有多种化学物质，其中 包括：水包括：水(91%)(91%)、蛋白质、蛋白质(7%)(7%)、脂质、脂质(1%)(1%)、糖类、糖类 (0.1%)(0.1%)、无机盐类、无机盐类(0.9%)(0.9%)、代谢产物：尿素、肌酐

7、、代谢产物：尿素、肌酐、 尿酸等。尿酸等。血浆蛋白血浆蛋白有白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原三有白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原三 类。当类。当与鸡胚胎汁混合后发生凝固，构成细胞生长的与鸡胚胎汁混合后发生凝固，构成细胞生长的 环境，有利于细胞向三维空间生长。缺点；易于液化。环境，有利于细胞向三维空间生长。缺点；易于液化。 鸡胚浸出液鸡胚浸出液：含有生长因子、大分子核蛋白和小分子：含有生长因子、大分子核蛋白和小分子 氨基酸等，有刺激细胞生长作用，为早年培养使用的氨基酸等，有刺激细胞生长作用，为早年培养使用的 培养用液，现已被合成培养液所代替。培养用液，现已被合成培养液所代替。 6/29/2021细胞生物学实

8、验 张伟 n水解乳蛋白水解乳蛋白：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的 产物，含有丰富的氨基酸。产物，含有丰富的氨基酸。 n胶原胶原：细胞生长的良好基质，利于细胞附着，：细胞生长的良好基质，利于细胞附着， 改善细胞表面性质，利于细胞生长。改善细胞表面性质，利于细胞生长。 n血清血清：天然培养基中最重为重要和组织培养中：天然培养基中最重为重要和组织培养中 最常使用的天然培养基。含有多种不可缺少的最常使用的天然培养基。含有多种不可缺少的 能维持细胞生长增值的成分。能维持细胞生长增值的成分。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 血清主要成分分类血清主要成分分类 u 多种蛋白

9、质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） u 多种金属离子多种金属离子 u 激素；激素； u 促贴附物质，如纤粘蛋白、胶原等。促贴附物质，如纤粘蛋白、胶原等。 u 各种生长因子各种生长因子 u 未知成分未知成分 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 血清的主要成分及含量血清的主要成分及含量 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 细胞培养中使用血清也有弊端细胞培养中使用血清也有弊端 n对大多数细胞来说血清不是它们接触的生理学对大多数细胞来说血清不是它们接触的生理学 液体液体 。 n含有一些对细胞会产生毒性的物质，如多胺氧含有一些对细胞会产生毒性的物质，如多胺氧 化

10、酶化酶 、补体、抗体等。、补体、抗体等。 n每批血清都有差别，其成分不能保持一致每批血清都有差别，其成分不能保持一致 。 n取材过程有可能带入支原体、病毒取材过程有可能带入支原体、病毒 。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 血清的质量标准血清的质量标准 n理化性质：重要指标球蛋白和血红蛋白含量。理化性质：重要指标球蛋白和血红蛋白含量。 n微生物检测：细菌、真菌、病毒、支原体等微生物检测：细菌、真菌、病毒、支原体等 n促细胞生长效果：克隆形成率、贴瓶率测定促细胞生长效果：克隆形成率、贴瓶率测定 法和连续传代培养法法和连续传代培养法 。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 血清的使用与储

11、存血清的使用与储存 n使用前处理：使用前处理：56305630分钟分钟 灭活补体。灭活补体。 n储存条件：储存条件：2020保存，避免反复冻融。保存，避免反复冻融。 n使用浓度使用浓度 ：一般为：一般为5 52020，最常用是，最常用是1010 。 n出现絮状沉淀物的处理出现絮状沉淀物的处理 ：直接使用或离心。：直接使用或离心。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 合成培养基合成培养基 目前已设计出许多种培养基，如目前已设计出许多种培养基，如DMEMDMEM、 RPMI-RPMI- 16401640、 TC199TC199、MEMMEM等。等。 成分：必需氨基酸、维生素、碳水化合物、无成分

12、：必需氨基酸、维生素、碳水化合物、无 机离子和其它辅助物质。机离子和其它辅助物质。 常需要添加的成分：常需要添加的成分：NaHCO3NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮、谷氨酰胺、丙酮 酸钠、酸钠、HEPESHEPES等等 优点优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成：标准化生产，组分和含量相对固定。成 本低本低 缺点缺点： 不能完全满足体外细胞生长需要。不能完全满足体外细胞生长需要。 只只 能维持细胞生存，常需补充一定量的天然培养基能维持细胞生存，常需补充一定量的天然培养基 （如血清）。（如血清）。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 完全培养基的组成完全培养基的组成 基础培养基基础培养基 80

13、80一一9595 血清血清 5 5一一2020 碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/L2.0 g/L 青、链霉素青、链霉素 各各100100单位毫升单位毫升 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 （3 3）消）消 化化 液液 胰蛋白酶胰蛋白酶 u胰蛋白酶是一种黄白色粉末，受胰蛋白酶是一种黄白色粉末，受Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+、 血清的抑制。血清的抑制。 u用无用无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的D-HanksD-Hanks缓冲液配制缓冲液配制, ,常用的常用的 胰蛋白酶液浓度是胰蛋白酶液浓度是0.250.25 ，pH8.0 pH8.0 。用滤器过滤。用滤器过滤 除菌。除菌。 u胰蛋

14、白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健， 除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从 而使细胞分离。而使细胞分离。 u胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限 度会损伤细胞。度会损伤细胞。 u用含血清培养液终止其对细胞的消化作用用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 EDTAEDTA溶液溶液：解离细胞，常用浓度：解离细胞，常用浓度0.02%0.02%，与胰酶，与胰酶 混合使用混合使用 胶原酶溶液胶原酶溶液：用于上皮细胞的原代培养

15、，作用于：用于上皮细胞的原代培养，作用于 胶原，对细胞影响很小。胶原，对细胞影响很小。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 （4） pH调整液 nNaHCONaHCO3 3溶液：溶液：NaHCONaHCO3 3是培养基中必须添加的成是培养基中必须添加的成 分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保 证培养基在证培养基在5%CO5%CO2 2的环境下的环境下pHpH达到设计标准。如达到设计标准。如 果是封闭式培养，即不与果是封闭式培养，即不与5%CO5%CO2 2的环境发生交换的环境发生交换 达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所达到平衡，所使用

16、的培养基就不能按照说明书所 要求加入要求加入NaHCONaHCO3 3。此时常用。此时常用5.6% or 7.4%5.6% or 7.4%的的 NaHCONaHCO3 3溶液调节培养基，使之达到所要求的溶液调节培养基，使之达到所要求的pHpH 环境。环境。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 nHEPESHEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌 嗪乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培嗪乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培 养基养基pHpH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细迅速变动。在开放式培养条件下，观察细 胞时培养基脱离了胞时培养基脱离

17、了5%CO25%CO2的环境，的环境，CO2CO2气体迅速气体迅速 逸出，逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此时可以维，此时可以维 持持pH7.0pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加左右。一般在进行克隆化培养时要添加 HEPESHEPES。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 培养基配制应注意的问题培养基配制应注意的问题 u认真查看说明书（成分、注意事项）认真查看说明书（成分、注意事项） u器皿要灭菌器皿要灭菌 u加温去离子水（灭菌）至加温去离子水（灭菌）至15-3015-30度度 u加入培养基干粉，搅拌至溶解加入培养基干粉，搅拌至溶解 u加入须补

18、充的成分、加入须补充的成分、NaHCONaHCO3 3、调节、调节pHpH后定容后定容 u用用0.22 0.22 m m以下孔径的微滤膜过滤以下孔径的微滤膜过滤 u分装分装，4 4 度储存，用时加入血清（终浓度度储存，用时加入血清（终浓度 1010 ） 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 二、实验目的二、实验目的 1. 1. 掌握掌握DMEMDMEM培养基、胰酶的配制培养基、胰酶的配制 2. 2. 学习学习针头滤器的使用方法针头滤器的使用方法 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 三、实验步骤三、实验步骤 ( (一）一） DMEMDMEM培养基的配制培养基的配制 1. 1. 水的准备水的

19、准备 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 2. 32. 3袋袋DMEMDMEM粉末用双蒸水溶解、磁力搅拌器搅拌粉末用双蒸水溶解、磁力搅拌器搅拌 半小时以上。半小时以上。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 加入加入3.6g NaHCO33.6g NaHCO3，定容至，定容至3000 mL3000 mL、搅拌、搅拌3030分钟。分钟。 4. 4. 每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、 名字。（留取少许做污染测试放名字。（留取少许做污染测试放CO2CO2培养箱培养箱7272小时）小时） 每每8 8个人为一组，每人过滤个人为一组，每人过滤90 mL90 mL。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 下周使用前在超净台内加入下周使用前在超净台内加入FCS FCS （胎牛血清）（胎牛血清） 10 10 mLmL，使血清的终浓度为，使血清的终浓度为10%10%，44保存待用。保存待用。 6/29/2021细胞生物学实验 张伟 （二）胰酶的配制（二）胰酶的配制 1. . 取无菌的取无菌的D DHanks Hanks 液液200 mL 200 mL （8 8人一组）人一组） 2. 2. 称取称取0. 5g0. 5g胰酶（胰酶（0.25%0.25%），在超净台中移至无菌），在超净台中移至无菌