分光光度计测定大曲中糖化酶活性课件

1、分光光度法测定大曲糖化酶活力 探讨 丁海艳 阅 大曲中糖化酶大曲中糖化酶 大曲中的微生物群比较复杂，主要有霉菌、酵母菌和细菌等，这些微大曲中的微生物群比较复杂，主要有霉菌、酵母菌和细菌等，这些微生生 物可以分泌很多胞外酶，真正起糖化作用的是物可以分泌很多胞外酶，真正起糖化作用的是葡萄糖葡萄糖淀淀粉粉酶酶 (Glucoamylase(Glucoamylase，EC3EC32 21 13)3)简称简称糖化糖化酶酶，是一种外切型糖苷酶，是一种外切型糖苷酶， 它从淀粉的非还原性末端依次水解它从淀粉的非还原性末端依次水解 一一1 1，4 4糖苷键，切下一个个葡糖苷键，切下一个个葡 萄糖单元，并像萄糖单元

2、，并像 一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变 化，形成化，形成 一一D D葡萄糖。当遇到支链淀粉的分支点时，它也可以水解葡萄糖。当遇到支链淀粉的分支点时，它也可以水解 一一1 1，6 6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也 能微弱水解能微弱水解 一一1 1，3 3糖苷键，它糖苷键，它一般都能将淀粉百分之百地一般都能将淀粉百分之百地 水解生成葡萄糖。水解生成葡萄糖。 我国大多采用次碘酸盐法测定糖化酶活力方 法存在速度慢，操作繁琐等缺 点，本文研 究利用分光光度计测量 3，5一二硝基水杨 酸

3、与还 原糖显色反应的吸光度值，并根据 吸光度值 与还原糖含量的相关关系确定糖 化酶活力，以期找到一种快速、准确测定 大曲糖化酶活力的方法。 实验方法 糖化酶活力测定原理 酶活力定义 ：1g1g酶液在酶液在 40 40、pHpH4.64.6的条件下，的条件下，1h1h分解分解 可溶性淀粉产可溶性淀粉产lmglmg葡萄糖的酶量定义为葡萄糖的酶量定义为 1 1个酶活力单位。个酶活力单位。 测定原理：淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，3 3，5 5一二一二 硝基水杨酸硝基水杨酸 (DNs) (DNs)与葡萄糖共热后被还原成棕红与葡萄糖共热后被还原成棕红 色的色的 3 3一氨基一一氨基

4、一5 5硝基水杨酸硝基水杨酸，在波长，在波长 520nm 520nm 处，处， 3 3一氨基一氨基- -5 5硝基硝基水水杨酸有强的光吸收。在一定浓度杨酸有强的光吸收。在一定浓度 范围内，反应液的吸光度值与葡萄糖的量呈正比，范围内，反应液的吸光度值与葡萄糖的量呈正比， 即反应液的吸光度值与糖化酶活力成正比。即反应液的吸光度值与糖化酶活力成正比。 标准曲线制作： 准确称取酶活为准确称取酶活为 861.9U 861.9Ug g的大曲的大曲 1.6g 1.6g，定容至，定容至 25mL 25mL 容量瓶中。取容量瓶中。取 6 6个个 50mL 50mL比色管，分别加入比色管，分别加入 2 2淀粉溶液

5、淀粉溶液 25mL25mL，0.1mol0.1molL L乙酸乙酸 - -乙酸钠缓冲液乙酸钠缓冲液 5mL 5mL，蒸馏水，蒸馏水2.0mL2.0mL、 1.6mL1.6mL1.2mL1.2mL0.8mL0.8mL、0.4mL0.4mL、0mL0mL，摇匀，摇匀，4040水浴水浴5min5min。 依次加入液体糖化酶稀释液依次加入液体糖化酶稀释液 0mL 0mL、0.4mL0.4mL、0.8mL0.8mL、1.2mL1.2mL、 1.6mL1.6mL、2.0mL2.0mL到比色管中，立即计时，反应到比色管中，立即计时，反应 30min 30min。分别向。分别向 比色管中添加比色管中添加202

6、0NaOH0.2mLNaOH0.2mL，迅速用水冷却，终止酶反应。，迅速用水冷却，终止酶反应。 分别取分别取 5mL 5mL反应液，用蒸馏水定容至反应液，用蒸馏水定容至 100mL 100mL，取取 0.5mL 0.5mL 稀释反应液到试管中，加入稀释反应液到试管中，加入 0 05mL DNS5mL DNS，沸水浴，沸水浴 3min 3min。分分 别向试管中加别向试管中加 8mL 8mL蒸馏水，在波长蒸馏水，在波长 520nm 520nm 处比色。处比色。 大曲糖化酶活力测定 糖化液、空白液的反应方法和国标一样，就后面 测定方法不一样。 测定方法：分别取分别取 5mL 5mL反应液（糖化液、

7、空白反应液（糖化液、空白 液），用蒸馏水定容至液），用蒸馏水定容至 100mL 100mL，取取 0.5mL 0.5mL 稀释反应液到试管中，加入稀释反应液到试管中，加入 0.5mL DNS 0.5mL DNS，沸水浴，沸水浴 3min3min。分别向试管中加分别向试管中加 8mL 8mL蒸馏水，在波长蒸馏水，在波长520nm 520nm 处比色。处比色。根据样品吸光度值在标准曲线上查出对根据样品吸光度值在标准曲线上查出对 应的糖化酶活力。应的糖化酶活力。 结果与讨论 不同浓度葡萄糖溶液与DNS共热后的吸光度值见表 1。 以酶活力为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准 曲线见附图。 由附图可知，在

8、一定酶浓度范围内，反应液的吸光 值与糖化酶活力成正比，其关系式为： Y=0000630X(式中x为糖化酶活力：Y为吸光度 值)。 表 1不同酶活力的吸光度值 加标回收 向样品中加入 lg已知酶活为 8619Ug的大曲， 反应测定糖化酶酶活力的变化，结果见表 2 由表由表 2 2可知，用分光光度法测定糖化酶酶活可知，用分光光度法测定糖化酶酶活 加标加标回回收收 率为率为 95.0%-105%95.0%-105%，相对标准偏，相对标准偏 差差1.0451.045，符，符合分析合分析 方法中的规定。方法中的规定。 表表 2 2 糖化酶酶活力的回收率糖化酶酶活力的回收率 对照实验对照实验 取 1g活力

9、为 861.9Ug 的酶液，分别用分光 光度计法和碘量法测 定糖化酶活力，结果 见表 3。 由表3可知，分光度计法 与碘量法测定的精确 度基本相当。 结论结论 实验表明，糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖与实验表明，糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖与3 3，5 5- - 二硝基水杨酸二硝基水杨酸 (DNs) (DNs)反应生成的棕红色反应生成的棕红色 3 3- -氨基氨基 5 5- -硝基水杨酸，在硝基水杨酸，在 520nm 520nm 波长处的光吸收强度与波长处的光吸收强度与 糖化酶活力呈正比糖化酶活力呈正比，可采用分光光度计法测量大可采用分光光度计法测量大 曲的糖化酶活力曲的糖化酶活力。 当吸光度值为当吸光度值为