康为世纪技术讲座-上医WBIF课件

1、 Western Blot & Immunofluorescence 北京康为世纪生物科技有限公司 技术总监 刘雪松 2 内 容 背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 2 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 生物学反应系统检测原理生物学反应系统检测原理 反应系统：蛋白与蛋白、核酸与核酸 指示系统： 酶、荧光素、同位素 3 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 4 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 直接法直接法 间接法间接法 5 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 背景知识 6

2、(epitope)是指抗原分子上具有决定和控制抗原特异性 的特殊化学基团,可与相应抗体相结合的部位。又称为 抗原决定簇。 (antigen,Ag)是一类能刺激人或动物机体产生特异性免 疫应答，并与免疫应答产物（抗体或效应细胞）结合， 发生免疫效应的物质。包括蛋白质，多糖，多肽等。 (antibody,Ab)机体在抗原物质刺激下，由B淋巴细胞分 化形成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结 合反应的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。 6 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 单克隆抗体和多克隆抗体 7 多克隆抗体： 多株B细胞针对多个抗原 决定簇产生的抗体。

3、多克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体： 由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细 胞产生的,只识别一种抗原表位的 具有高度特异性的抗体。 7 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 制备单克隆抗体的流程制备单克隆抗体的流程 8 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 抗原的种类抗原的种类 一 颗粒性抗原 细胞，细菌 二 可溶性抗原 表达蛋白 合成多肽 细菌或病毒的某种蛋白 9 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 抗原的要求抗原的要求 1 抗原量的要求，蛋白2mg,多肽 56mg 2 纯度要求，蛋白纯度要90%以上， SDS-PAGE要一条带，多肽纯度要 85%以

4、上。 3 蛋白背景，是否带有标签蛋白？与其 他蛋白的同源性 10 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 康为提供的服务康为提供的服务 1 蛋白表达，制备抗体 2 客户提供蛋白序列，我们提供蛋白表位预测、多 肽合成，多肽与载体交联，制备抗体 3 抗体制备后的后续服务， 抗体的纯化，蛋白A/G，抗原或多肽的特异性亲 和纯化 抗体的标记，HRP，FITC 抗体识别不同表位的测定 ELISA 配对抗体的筛选 IHC、WB 的应用 11 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 1212 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 一抗和二抗 13 一抗：针对抗原的

5、抗体 二抗：针对一抗的抗体 单克隆抗体 多克隆抗体 带标记的抗体（生物素、HRP、 AP） 13 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 应 用 v 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 v 细胞中特异蛋白质的半定量分析 v 蛋白质分子的相互作用研究 14 14 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 抗体的化学结构及其模式图 15 免疫球蛋白根据重链结构命名： IgG(), IgA()，IgD(), IgE()， IgM() 15 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 抗体的化学结构及其模式图 16 五种免疫球蛋白只有两种类型的 轻链： Kappa()

6、和Lambda() 每个抗体分子的轻链必须相同； 某一单独的抗体分子决不可能既有 链又有链。这一点在免疫组化的淋 巴瘤诊断中十分重要。 16 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 17 内容 背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 17 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而 后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 18 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 19 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 20 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座

7、-上医上医 WBIF 21 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 22 SDS-PAGE 22 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 23 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 24 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 转移方法 v 半干转 v 湿转 25 注意：对于大分子量的 蛋白建议使用湿转 25 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 26 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 27 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 28 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBI

8、F HRP（辣根过氧化酶（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）（碱性磷酸酶） 大小大小40Kd140Kd 最佳酶活性最佳酶活性PH：57PH：810 酶活和二抗特异性酶活和二抗特异性好于好于AP 抑制剂抑制剂氰化物氰化物 硫化物硫化物 叠氮钠叠氮钠 氰化物氰化物 砷酸盐，有机磷砷酸盐，有机磷 二价阳离子螯合剂二价阳离子螯合剂 稳定性稳定性零度以下稳定零度以下稳定零度以下不稳定零度以下不稳定 底物底物很多很多部分部分 动力学特性动力学特性快速快速慢慢 价格价格便宜便宜昂贵昂贵 发光底物发光底物 ECL 显色底物显色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP 29 康为世纪技术讲座康为

9、世纪技术讲座-上医上医 WBIF 30 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 31 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 3232 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF u 样品丰度 u 检测灵敏度 33 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 34 内容 背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IHC操作流程4 IHC常见问题分析5 34 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 35 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 36 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 37 康为世

10、纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 信号弱或者无信号信号弱或者无信号 38 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 39 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 40 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 41 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF A 1：5000 B 1：10000 C 1:5000 D 1:10000 抗血清检测结果抗血清检测结果 42 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 43 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 44 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 W

11、BIF 推荐 u 对照设置 内参照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH 阳性对照 检测一抗是否正常 阴性对照 检测一抗特异性 空白对照 不加一抗，光加二抗，检测二抗是否发生交叉反应 4545 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF u 优化条件 46 打造完美的实验结果打造完美的实验结果 46 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 47 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 45K 45K 35K Beta-actin 漂洗 GAPDH 48 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 49 康为世纪技术讲座康为

12、世纪技术讲座-上医上医 WBIF 50 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 内容 背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 51 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 52 免疫荧光概念 免疫荧光（Immunofluorescence）技术是利用抗原抗体特异性结合 的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或 定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质 进行细胞或组织内的精确定位。 52 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 53 常用的荧光染料常用的荧光染料 显示

13、绿色荧光：Fluorescein isothocyancie(FITC), Alexa-488 显示红色荧光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594 显示蓝色荧光：Alexa350 53 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 54 直接法 间接法 54 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 55 免疫荧光操作过程 第二步 第三步 第一步 待测样本的准备 爬片 固定 封闭 取材 冰冻 切片 免疫荧光染色 一抗结合 二抗结合 衬 染 细胞爬片 冰冻切片 染色 后处理 封片 55 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医

14、WBIF 56 56 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF v待测样品的准备 5757 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 取材和固定 v 细胞爬片的制备 v 固定 目 的： 通过物理和化学方法使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外 源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止细胞自溶 常用方法： 甲醇、多聚甲醛或丙酮 ，室温，一般为10-20min。 58 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 透化和封闭 v 透化：0.2Triton X100 （丙酮固定法不用透化处理 ） v 封闭：二抗相同宿主的血清封闭 59 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医

15、 WBIF 一抗及二抗孵育一抗及二抗孵育 60 v 一抗4度湿盒内过夜，或37 1-2小时 v 二抗室温2小时（避光），或者37度1个半小时 v PBS洗三遍 60 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 衬 染 61 伊文氏蓝，红色荧光。 DAPI染核，蓝色荧光。 61 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 封 片 95甘油封片 抗淬灭剂 6262 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF v特异性荧光强度： 63 （-）无荧光；）无荧光； （）极弱的可疑荧光；）极弱的可疑荧光； （+）荧光较弱，但清楚可见；）荧光较弱，但清楚可见； （+）荧光明亮；

16、）荧光明亮； （+ -+）荧光闪亮。）荧光闪亮。 63 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 镜下观察 64 Indirect immunofluorescence of iron-regulated cell wall mannoprotein FIT1 of S. cerevisiae 64 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 镜下观察 65 Confocal image to detect phosphorylated AKT (green) in cardiomyocytes infected with adenovirus 65 康为世纪技术讲座康为

17、世纪技术讲座-上医上医 WBIF 66 内容 背景知识1 WB操作流程2 WB常见问题分析3 IF操作流程4 IF常见问题分析5 66 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 67 IF常见问题分析 1.设立实验对照 2.出现背景 3.信号微弱 67 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 68 设立实验对照 阳性对照：没有阳性对照就无法做出真正的阴性结果判断。 阴性对照：没有阴性对照就无法做出真正的阳性结果判断。 找到合适的阳性对照和阴 性对照是正确判断实验结 果的保障 荧光标记物对照：荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 68 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上

18、医上医 WBIF 69 结果判断标准 1.设立好对照是前提 2.阳性信号必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性 3.阴性结果不能视为抗原不表达 4.避免假阳性和假阴性的发生 不在特定部位，不视为阳性 即使1个细胞阳性，也视为阳性 Barrier Filters 69 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 70 出现背景的几种原因 1.正常动物血清使用不合理 ：如二抗为羊抗兔IgG，应该用羊的正常血清。 3.缓冲液洗涤不够干净 ：增加清洗次数并延长时间，减少残液，缓冲液每次更换。 4.抗体稀释不合理，浓度太高 2.缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20 70 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 71 如何最大限度减低背景 1.合适的一抗浓度 ：检测推荐稀释度上下两个梯度。 2.实验组织 ：及时固定新鲜的细胞 3.优先选择单抗 ：多抗有非特异性着色。 4.PBS冲洗充分：冲洗不充分有非特异性着色。 6.避免细胞过于干燥 ：否则无法补救。 5.缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20 71 康为世纪技术讲座康为世纪技术讲座-上医上医 WBIF 72 荧光减弱 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱