酶的分离与纯化课件

1、酶的分离与纯化1 第四讲第四讲 酶的分离与纯化酶的分离与纯化 讲课：阳讲课：阳 飞飞 系部：生化系系部：生化系C-312 制作：郑穗平 酶的分离与纯化2 第四讲第四讲 酶的分离与纯化酶的分离与纯化 n教学目标：教学目标： 了解酶纯化方法的原理、步骤、特点以及策略了解酶纯化方法的原理、步骤、特点以及策略 理解酶分离纯化的一般原则理解酶分离纯化的一般原则、酶分离和纯化方法、酶分离和纯化方法 掌握细胞破碎的方法及酶分离纯化的方法及原理掌握细胞破碎的方法及酶分离纯化的方法及原理 n教学重点：教学重点： 细胞破碎的方法与特点、酶分离方法细胞破碎的方法与特点、酶分离方法 n教学难点：教学难点： 酶分离方法

2、特点酶分离方法特点 酶的分离与纯化3 第四讲第四讲 酶的分离与纯化酶的分离与纯化 4.14.1、酶的提取和分离纯化、酶的提取和分离纯化 4.24.2、酶的分离纯化策略、酶的分离纯化策略 4.34.3、酶的分离纯化与制备过程、酶的分离纯化与制备过程 GoGo GoGo GoGo 酶的分离与纯化4 4.14.1、酶的提取和分离纯化、酶的提取和分离纯化 细胞破碎细胞破碎 提取酶提取酶 酶分离纯化酶分离纯化 酶浓缩酶浓缩 酶贮存酶贮存 动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞 发酵液发酵液 离心分离、过滤分离、沉淀分离心分离、过滤分离、沉淀分 离、层析分离、电泳分离、萃离、层析分离、电泳分离、萃

3、取分离、结晶分离等取分离、结晶分离等 指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。 已知绝大多数酶是蛋白质，因此用于蛋白质分离纯化的方法一般也适用于酶的分离纯化。已知绝大多数酶是蛋白质，因此用于蛋白质分离纯化的方法一般也适用于酶的分离纯化。 酶的分离与纯化5 酶的分离纯化一般程序：酶的分离纯化一般程序： l预处理：预处理：材料的选择、发酵液预处理、细胞破碎材料的选择、发酵液预处理、细胞破碎 l粗分级分离：粗分级分离：又称初步纯化或提取，采用适当的又称初步纯化或提取，采用适当的 方法将目的

4、酶与其他杂蛋白分离开方法将目的酶与其他杂蛋白分离开 l细分级分离：细分级分离：又称高度纯化，即酶的精制又称高度纯化，即酶的精制 l成品制作：成品制作：使酶与溶剂分离。使酶与溶剂分离。 酶的分离与纯化6 4.24.2、酶的分离纯化策略、酶的分离纯化策略 l防止酶的变性失活防止酶的变性失活 l储存及所有操作一般在低温下（储存及所有操作一般在低温下（04）进行）进行 l整个过程中反应系统整个过程中反应系统pH要适中（要适中（pH46） l操作中应尽量避免激烈搅拌以减少泡沫形成操作中应尽量避免激烈搅拌以减少泡沫形成 1 1、基本原则基本原则 酶的分离与纯化7 2 2、分离纯化策略、分离纯化策略 1 1

5、）目的明确）目的明确 2 2）建立一个可靠、快速的分析方法）建立一个可靠、快速的分析方法 3 3）纯化方法的选择）纯化方法的选择 酶的分离与纯化8 1）目的明确 u酶分离纯化的最终目的就是要获得高纯度的酶，使使 用的目用的目的不同，对酶的纯度要求也不同。 u纯度的要求必须考虑到原料的性质、终产物的预期 用途和特殊的安全性问题。 u所有关于目标酶蛋白目标酶蛋白及关键杂质关键杂质的性质的信息都有 助于指导人们在纯化过程中选择分离技术和操作条 件。 u虽然纯化的步骤越少越好纯化的步骤越少越好，但必须保证终产物的质必须保证终产物的质 量量。应尽早除去可引起目标蛋白降解、失活或干扰 分析的杂质。在每个纯

6、化步骤中都应考虑维持酶蛋 白的生物活性。 酶的分离与纯化9 2 2）建立一个可靠、快速的分析方法）建立一个可靠、快速的分析方法 l快速、可靠的快速、可靠的分析目标酶蛋白分析目标酶蛋白的方法的方法 l蛋白质纯度检测蛋白质纯度检测方法方法 l总蛋白量检测总蛋白量检测方法方法 l对必须清除的对必须清除的杂质杂质的分析方法的分析方法 酶的分离与纯化10 3 3）纯化方法的选择）纯化方法的选择 l纯化过程纯化过程不宜重复相同的步骤和条件不宜重复相同的步骤和条件 l减少减少添加剂添加剂的使用的使用 l尽早去除有破坏性的尽早去除有破坏性的杂质杂质 l尽早采用尽早采用高效分离方法高效分离方法，将，将最昂贵最费

7、时最昂贵最费时的分离方的分离方 法放在最后阶段法放在最后阶段 评价纯化方法好坏标准评价纯化方法好坏标准：比活力提高倍数、总活力的回收率、重现性：比活力提高倍数、总活力的回收率、重现性 酶纯度检验酶纯度检验：电泳法、高效液相色谱法电泳法、高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)、化学结构分析法、化学结构分析法、 超离心沉降分析法、免疫学法、分光光度法超离心沉降分析法、免疫学法、分光光度法 酶的分离与纯化11 4.34.3、酶的分离纯化与制备过程、酶的分离纯化与制备过程 1 1、材料的预处理、材料的预处理 2 2、细胞破碎（胞内酶）、细胞破碎（胞内酶） 3 3、酶的提取、酶的提取 4 4、酶的分离纯

8、化方法及选择、酶的分离纯化方法及选择 5 5、酶的精制及方法、酶的精制及方法 6 6、酶制剂的类型、酶制剂的类型 酶的分离与纯化12 1 1、材料的预处理、材料的预处理 u酶的来源于酶的来源于动物、植物的器官组织、微生物细胞动物、植物的器官组织、微生物细胞 发酵发酵。 u微生物细胞产酶包括微生物细胞产酶包括胞内酶胞内酶与与胞外酶胞外酶，两种情况，两种情况 都涉及将微生物细胞与发酵液进行都涉及将微生物细胞与发酵液进行分离分离。 u常用的分离方法主要是常用的分离方法主要是离心离心和和过滤过滤两种。两种。 酶的分离与纯化13 2、细胞破碎（胞内酶） l指采用物理、化学或生物的方法使指采用物理、化学或

9、生物的方法使细胞壁或细胞膜细胞壁或细胞膜 破碎破碎，从而使得细胞内的酶得到释放。，从而使得细胞内的酶得到释放。 l细胞破碎的方法可分为细胞破碎的方法可分为机械法机械法和和非机械法非机械法两类。目两类。目 前工业上最常用的是前工业上最常用的是机械法机械法。 JY92-II D超声波超声波 细胞粉碎机细胞粉碎机 高压细胞破碎机高压细胞破碎机 DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机 细胞破碎珠细胞破碎珠 酶的分离与纯化14 机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂：有机溶剂： 甲苯、丙酮甲苯、丙酮 丁醇、氯仿丁醇、氯仿 表面活性

10、剂：表面活性剂： Triton、Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎而达到细胞破碎 细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及

11、其原理 酶的分离与纯化15 3 3、酶的提取、酶的提取 l指在一定条件下，用适当的指在一定条件下，用适当的溶剂或溶液处理溶剂或溶液处理含酶原料，含酶原料， 使酶使酶充分溶解充分溶解到溶剂或溶液中的过程到溶剂或溶液中的过程, ,也称为也称为酶的抽提酶的抽提。 l首先应根据首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一。一 般说来，般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶 于非极性的有机溶剂中；酸性物质易溶于碱性溶剂中，于非极性的有机溶剂中；酸性物质易溶于碱性溶剂中， 碱性物质易溶于酸性溶剂中碱性物质易溶于酸性溶剂

12、中。 l一般酶都能溶解于水，通常可用一般酶都能溶解于水，通常可用水水或或稀酸、稀碱、稀盐稀酸、稀碱、稀盐 溶液等进行提取溶液等进行提取，有些酶与，有些酶与脂质脂质结合或含有较多的结合或含有较多的非极非极 性基团性基团，则可用，则可用有机溶剂有机溶剂提取。提取。 l为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程 中还要注意控制好中还要注意控制好温度、温度、pHpH值值等提取条件。等提取条件。 酶的分离与纯化16 酶的主要提取方法酶的主要提取方法 提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象 盐溶液提取盐溶液提取0.020.5m

13、ol/L的盐溶液的盐溶液用于提取在用于提取在低浓度低浓度盐溶液中溶解盐溶液中溶解 度较大的酶度较大的酶 酸溶液提取酸溶液提取pH26的水溶液的水溶液用于提取在用于提取在稀酸溶液稀酸溶液中溶解度大，中溶解度大， 且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶 碱溶液提取碱溶液提取pH812的水溶液的水溶液用于提取在用于提取在稀碱溶液稀碱溶液中溶解度大中溶解度大 且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶 有机溶剂提取有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或用于提取那些与脂质结合牢固或 含有较多含有较多非极性基团非极性基团的酶的酶 酶的分离与纯化17 讨论：讨论：提高酶分子扩散速度

14、手段提高酶分子扩散速度手段 u提高温度提高温度 u降低溶液粘度降低溶液粘度 u增加扩散面积增加扩散面积 u缩短扩散距离缩短扩散距离 u增大浓度差增大浓度差 酶的分离与纯化18 4 4、酶的分离纯化方法、酶的分离纯化方法 l一、根据一、根据溶解度溶解度不同建立的纯化方法不同建立的纯化方法 l二、按照二、按照分子大小分子大小不同建立的纯化方法不同建立的纯化方法 l三、依据三、依据电学解离性质电学解离性质不同建立的纯化方法不同建立的纯化方法 l四、利用四、利用亲和作用特性亲和作用特性建立的纯化方法建立的纯化方法 l五、利用五、利用稳定性差异稳定性差异建立的纯化方法建立的纯化方法 盐析法盐析法有机溶剂

15、沉淀法有机溶剂沉淀法等点沉淀法等点沉淀法有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法 萃取分离萃取分离 凝胶过滤凝胶过滤膜分离膜分离 离子交换色谱离子交换色谱电泳电泳聚焦色谱聚焦色谱 亲和色谱亲和色谱亲和膜亲和膜 热变性法热变性法 酸碱变性法酸碱变性法表面变性法表面变性法 酶的分离与纯化19 盐析法盐析法 l大多数蛋白类酶都溶于水，而且在大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐低浓度的盐存在存在 的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这 称为称为盐溶现象盐溶现象。 酶的分离与纯化20 l在高浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度增加 而减少而沉淀而析出，这种现

16、象称为盐析盐析。 酶的分离与纯化21 盐析方法：盐析方法： lKs分段盐析： 在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改 变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法 l分段盐析： 在一定的盐和离子强度的条件下（Ks为常数），通 过改变温度和pH值，使不同酶或蛋白质分离的方法 酶的分离与纯化22 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、 硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等，其硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等，其 中以中以硫酸铵硫酸铵最为常用。最为常用。 u溶解度大溶解度大(25时达时达4.1molL) u溶解温度系数小溶解温度系数小(0

17、为为706gL，25为为767gL)， 即使是在低温的溶解度范围内，几乎所有的蛋白质即使是在低温的溶解度范围内，几乎所有的蛋白质 都能盐析出来都能盐析出来 u价格便宜价格便宜 u浓度高时不易引起蛋白质生物活性的丧失浓度高时不易引起蛋白质生物活性的丧失 酶的分离与纯化23 u在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度饱和度表示。表示。 饱和度指溶液中饱和硫酸铵体积与溶液总体积之比饱和度指溶液中饱和硫酸铵体积与溶液总体积之比 u添加方法：添加方法： 1 1）添加饱和硫酸铵溶液）添加饱和硫酸铵溶液 2 2）加固体硫酸铵，固体硫酸铵的加入量可以查表）加固体硫酸铵，固体硫

18、酸铵的加入量可以查表 酶的分离与纯化24 分析盐析的特点及影响因素分析盐析的特点及影响因素 l优点：优点： 操作简便、安全、重现性好，适用范围广泛，同操作简便、安全、重现性好，适用范围广泛，同 时能够达到浓缩蛋白质的目的。时能够达到浓缩蛋白质的目的。 l缺点：缺点： 分辨率差、纯度倍数低、沉淀含有大量的盐分分辨率差、纯度倍数低、沉淀含有大量的盐分 l影响因素：影响因素： pHpH值、温度、蛋白质浓度等值、温度、蛋白质浓度等 酶的分离与纯化25 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 l原理：原理： 利用酶在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法利用酶在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法 l常用的有机

19、溶剂：乙醇、常用的有机溶剂：乙醇、丙酮丙酮、异丙醇、甲醇等、异丙醇、甲醇等 酶的分离与纯化26 有机溶剂沉淀法要求：有机溶剂沉淀法要求： u溶剂必须能与水完全混合，不与蛋白质发生反应；溶剂必须能与水完全混合，不与蛋白质发生反应； u溶剂蒸气无毒且不易燃烧；溶剂蒸气无毒且不易燃烧； u溶剂用量一般为酶液体积的溶剂用量一般为酶液体积的2 2倍左右，必须预先冷却倍左右，必须预先冷却 到到-20-20左右在搅拌下缓慢加入；左右在搅拌下缓慢加入； u沉淀析出后尽快在低温下（沉淀析出后尽快在低温下（00以下）离心分离，用以下）离心分离，用 冷缓冲液溶解以降低有机溶剂的浓度；冷缓冲液溶解以降低有机溶剂的浓度

20、； upHpH尽可能在靠近目标酶的等电点。尽可能在靠近目标酶的等电点。 酶的分离与纯化27 有机溶剂沉淀法的特点：有机溶剂沉淀法的特点： l优点：优点： 分辨率高，溶剂容易除去。分辨率高，溶剂容易除去。 l缺点：缺点： 蛋白质在有机溶剂中易变性。蛋白质在有机溶剂中易变性。 酶的分离与纯化28 等电点沉淀法等电点沉淀法 l原理：原理： 利用两性电解质在利用两性电解质在等电点时溶解度最低等电点时溶解度最低，以及不，以及不 同的两性电解质具有不同的等电点，通过同的两性电解质具有不同的等电点，通过调节溶液调节溶液 的的pHpH值值，使酶或杂质沉淀析出。，使酶或杂质沉淀析出。 l在加酸或加碱调节在加酸或

21、加碱调节pHpH值过程中，值过程中，边加边搅拌并缓慢边加边搅拌并缓慢 进行进行，以防止局部过酸或过碱而引起酶变性失活。，以防止局部过酸或过碱而引起酶变性失活。 l由于在等电点时酶蛋白分子表面的由于在等电点时酶蛋白分子表面的水化膜水化膜仍然存在，仍然存在， 使酶仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，一般很使酶仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，一般很 少单独使用。少单独使用。 酶的分离与纯化29 有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法 l原理：原理： 在酶液中加入某些在酶液中加入某些高分子物质高分子物质，使其与酶，使其与酶形成聚合形成聚合 物物而沉淀下来。而沉淀下来。 l离子型表面活性剂：十二烷基磺酸钠离子

22、型表面活性剂：十二烷基磺酸钠(SDS)(SDS)； l非离子型聚合物：聚乙二醇非离子型聚合物：聚乙二醇(PEG) (PEG) l聚丙烯酸聚丙烯酸：因为聚丙烯酸上带有大量的羧基，沉淀：因为聚丙烯酸上带有大量的羧基，沉淀 带正电的蛋白质，两者结合形成很大的颗粒而沉淀带正电的蛋白质，两者结合形成很大的颗粒而沉淀 下来，加入钙离子后，聚丙烯酸形成钙盐，使蛋白下来，加入钙离子后，聚丙烯酸形成钙盐，使蛋白 质游离出来，从而使蛋白质纯化。质游离出来，从而使蛋白质纯化。 酶的分离与纯化30 萃取分离萃取分离 l原理：原理： 利用溶质在互不相溶的两相之间利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同分配系数的不同而

23、而 分离。分离。 u双水相萃取双水相萃取 u超临界流体萃取超临界流体萃取 u反胶团萃取反胶团萃取 酶的分离与纯化31 双水相萃取双水相萃取 l原理：原理： 利用酶和杂蛋白等在不混溶的两个水相利用酶和杂蛋白等在不混溶的两个水相 系统中分配系数的不同而达到分离目。系统中分配系数的不同而达到分离目。 l优点：优点： 萃取过程条件温和（两相中含有萃取过程条件温和（两相中含有70以上的水），酶活以上的水），酶活 力损失较少，处理量可大可小；力损失较少，处理量可大可小； 设备简单，仅需一个储罐和一个离心力不高的普通离心设备简单，仅需一个储罐和一个离心力不高的普通离心 机；机； 操作方便、快捷，回收率一般可

24、达操作方便、快捷，回收率一般可达8090。 酶的分离与纯化32 各种双水相系统各种双水相系统 聚合物聚合物P聚合物聚合物Q或盐或盐 聚丙二醇聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡 咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖 聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 甲基纤维素甲基纤维素羟甲基葡聚糖，葡聚糖羟甲基葡聚糖，葡聚糖 乙基羟乙基纤维素乙基羟乙基纤维素葡聚糖葡聚糖 羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖 聚蔗糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖 聚乙二醇聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠硫酸镁，硫酸

25、铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠 酶的分离与纯化33 利用利用PEGl500NaH2PO4体系三步双水相萃取法体系三步双水相萃取法 l回收率达回收率达96.396.3，纯化倍数为，纯化倍数为3333 酶的分离与纯化34 超临界流体萃取超临界流体萃取 l原理：原理： 将超临界流体作为萃取溶剂，利用分离物质与杂质将超临界流体作为萃取溶剂，利用分离物质与杂质 在超临界流体中的溶解度不同分离。在超临界流体中的溶解度不同分离。 l超临界流体：超临界流体：指物质状态超过临界点后的流体。指物质状态超过临界点后的流体。 物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间，黏度大物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间，黏

26、度大 大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质扩散；大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质扩散； 扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍，可迅速渗扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍，可迅速渗 透到物体的内部而溶解目标物质，快速达到萃取平衡。透到物体的内部而溶解目标物质，快速达到萃取平衡。 酶的分离与纯化35 常见超临界流体的超临界点和超临界密度常见超临界流体的超临界点和超临界密度 流体名称流体名称临界温度临界温度()临界压力临界压力 (Mpa) 临界密度临界密度 （g/ml） 乙烷乙烷C2H632.34.880.203 丙烷丙烷C3H896.94.260.220 丁烷丁烷C4H1

27、0152.03.800.228 戊烷戊烷C5H12296.73.280.232 乙烯乙烯C2H49.95.120.227 氨氨NH3132.411.280.236 二氧化碳二氧化碳 CO231.17.380.46 二氧化硫二氧化硫 SO2157.67.880.525 水水H2O374.322.110.326 笑气笑气N2O36.57.170.451 氟里昂氟里昂C28.83.900.578 酶的分离与纯化36 最常用超临界流体为最常用超临界流体为CO2 l临界点的温度为临界点的温度为31.1，接近常温，接近常温 l临界压力较低，为临界压力较低，为7.38MPa l无毒、操作较安全，且液体二氧化

28、碳的扩散系数大，无毒、操作较安全，且液体二氧化碳的扩散系数大， 可获得高的传递速率可获得高的传递速率 l溶剂容易从产品中分离出来溶剂容易从产品中分离出来 酶的分离与纯化37 反胶团萃取反胶团萃取 l反胶团反胶团是是两性表面活性剂两性表面活性剂在在非极性有机溶剂非极性有机溶剂中中亲水基团亲水基团自发自发 地向内聚集而成的微小胶团，反胶团的形成使地向内聚集而成的微小胶团，反胶团的形成使有机相内形成有机相内形成 了分散的亲水微环境了分散的亲水微环境，使生物分子在有机相，使生物分子在有机相( (萃取相萃取相) )内存在内存在 于反胶团的亲水微环境中，消除了蛋白质难溶于有机相中或于反胶团的亲水微环境中，

29、消除了蛋白质难溶于有机相中或 在有机相中发生不可逆变性的现象。在有机相中发生不可逆变性的现象。 l表面活性剂类型：阴离子型、阳离子型、非离子型。表面活性剂类型：阴离子型、阳离子型、非离子型。 l非极性有机溶剂：环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷。非极性有机溶剂：环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷。 l通过控制通过控制pHpH值、离子强度、有机溶剂的种类以及表面活性剂值、离子强度、有机溶剂的种类以及表面活性剂 的种类和浓度等条件，可以改变蛋白质在两相中的分配系数，的种类和浓度等条件，可以改变蛋白质在两相中的分配系数， 不同蛋白质表面电荷与相对尺寸的不同使得它在两相中的分不同蛋白质表面电荷与相对尺寸的不同使得它在

30、两相中的分 配系数不同，从而达到分离的目的。配系数不同，从而达到分离的目的。 l特点：特点： 成本低、溶剂反复使用、萃取率和反萃取率高、防止酶失活成本低、溶剂反复使用、萃取率和反萃取率高、防止酶失活 酶的分离与纯化38 凝胶过滤（也称凝胶色谱）凝胶过滤（也称凝胶色谱） l原理：原理： 利用凝胶的网状结构利用凝胶的网状结构根据分子大小根据分子大小进行分离，通常进行分离，通常 以柱色谱的方式进行，柱中填充的介质是具有一定以柱色谱的方式进行，柱中填充的介质是具有一定 孔径的球状凝胶物质，常用于生物大分子的分离。孔径的球状凝胶物质，常用于生物大分子的分离。 l特点：特点： 快速、简便、不需要再生处理即

31、可反复使用。快速、简便、不需要再生处理即可反复使用。 酶的分离与纯化39 凝胶过滤介质品种：凝胶过滤介质品种： l葡聚糖系列、琼脂糖系列、聚丙烯酰胺系葡聚糖系列、琼脂糖系列、聚丙烯酰胺系 列、列、Sephacryl系列、系列、Sephadex系列、聚乙系列、聚乙 烯醇系列、烯醇系列、Bio-Beads SX系列等。系列等。 l最常用的凝胶有最常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺 凝胶、琼脂糖凝胶凝胶、琼脂糖凝胶排列组成的链状多糖等。排列组成的链状多糖等。 酶的分离与纯化40 u柱色谱操作：柱色谱操作：色谱介质的平衡、装柱、加样、扩展色谱介质的平衡、装柱、加样、扩展 (包括洗

32、涤和洗脱包括洗涤和洗脱)以及与此同时进行的流出液成分以及与此同时进行的流出液成分(蛋白蛋白 质或酶活性质或酶活性)的检测和收集。的检测和收集。 酶的分离与纯化41 酶的分离与纯化42 酶的分离与纯化43 膜分离膜分离 l原理：原理： 利用微孔超滤膜选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的。利用微孔超滤膜选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的。 l分类：分类： 根据膜分离过程推动力本质分类：根据膜分离过程推动力本质分类： 按材料分：天然高分子材料膜、有机按材料分：天然高分子材料膜、有机( (合成合成) )高分子聚合物膜、高分子聚合物膜、 无机多孔材料膜无机多孔材料膜 按膜结构：对称性膜、不对称

33、膜、复合膜按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜 按膜孔径大小进行分类：按膜孔径大小进行分类： 酶的分离与纯化44 超滤技术超滤技术 l超滤技术是近年来依托于材料科学发展起来的先进超滤技术是近年来依托于材料科学发展起来的先进 的膜分离技术，超滤分离精度介于纳滤与微滤之间。的膜分离技术，超滤分离精度介于纳滤与微滤之间。 l超滤膜通常使用的材料都是高分子聚合物，如聚砜超滤膜通常使用的材料都是高分子聚合物，如聚砜 类、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素等。类、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素等。 l通常超滤膜所标称的截留分子质量，对具有相同分通常超滤膜所标称的截留分子质量，对具有相同分 子质量的线形分子

34、和球形蛋白质类分子，物质的截子质量的线形分子和球形蛋白质类分子，物质的截 留率分别应留率分别应90和和95。 l目前常用超滤膜的截留分子质量范围在目前常用超滤膜的截留分子质量范围在11000kDa 之间。之间。 酶的分离与纯化45 工业上常用超滤膜器件工业上常用超滤膜器件 膜组件膜组件比表面积比表面积 （m2/m3） 设备设备 费用费用 操作费操作费膜面吸附层膜面吸附层 的控制的控制 应用应用 管式管式2030极高极高高高很容易很容易UF、MF 平板式平板式400600高高低低容易容易UF、MF 螺旋卷式螺旋卷式8001000低低低低难难UF、MF、 RO 毛细管式毛细管式6001200低低低

35、低容易容易UF、MF、 中空纤维式中空纤维式10000很低很低低低很难很难UF、RO 酶的分离与纯化46 酶的分离与纯化47 离子交换色谱离子交换色谱 l原理：利用离子交换剂上的可解离基团对各种原理：利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子离子的作用的作用 力不同而达到分离目的。通常是在固定相和流动相之间发力不同而达到分离目的。通常是在固定相和流动相之间发 生的可逆的离子交换反应。生的可逆的离子交换反应。 l离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质，通离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质，通 过在不溶性高分子物质过在不溶性高分子物质(母体母体) 引入可解离的基团（活性基团）引入可

36、解离的基团（活性基团） 而制成的，这些基团在水溶液中可与其它阳离子或阴离子而制成的，这些基团在水溶液中可与其它阳离子或阴离子 起交换作用。起交换作用。 l按照离子交换剂的不同又可分为按照离子交换剂的不同又可分为阳离子交换剂阳离子交换剂(cation exchanger)和和阴离子交换剂阴离子交换剂(anion exchanger。 l解离基团为强电离基团的称为强离子交换剂，碘酸基是强解离基团为强电离基团的称为强离子交换剂，碘酸基是强 阳离子交换剂。而带有弱解离基团的称为弱离子交换剂，阳离子交换剂。而带有弱解离基团的称为弱离子交换剂， 如羧甲基是弱酸性阳离子交换剂。如羧甲基是弱酸性阳离子交换剂。

37、 酶的分离与纯化48 离子交换色谱操作过程：离子交换色谱操作过程： 预处理预处理 加样吸附加样吸附 洗涤洗涤 洗脱洗脱 酶的分离与纯化49 电电 泳泳 l原理：原理： 利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化。利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化。 分类：分类： (1)(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2)(2)等电聚焦电泳等电聚焦电泳 (3)(3)连续凝胶电泳连续凝胶电泳 (4)(4)连续流动电泳连续流动电泳 (5)(5)无载体连续流动电泳无载体连续流动电泳 酶的分离与纯化50 (1)聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳： (polyacrylami

38、de gel electrophoresis，PAGE) l以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，由单体丙烯酰胺以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，由单体丙烯酰胺 (acrylamide)和亚甲基双丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylene bisacryl amide)聚合而成的。聚合而成的。 lPAGE是蛋白质研究中最常用的电泳方法，常用的聚丙是蛋白质研究中最常用的电泳方法，常用的聚丙 烯酰胺凝胶电泳是烯酰胺凝胶电泳是垂直平板电泳垂直平板电泳，以不连续方式进行，以不连续方式进行， 即电泳的胶与缓冲体系都具有不连续性。即电泳的胶与缓冲体系都具有不连续性。 l特点：特点： 浓缩效应、电荷效应、分

39、子筛效应、高分辨率浓缩效应、电荷效应、分子筛效应、高分辨率 SDS-PAGE主要用于蛋白质的纯度分析和分子量测定。主要用于蛋白质的纯度分析和分子量测定。 酶的分离与纯化51 (2)等电聚焦电泳：等电聚焦电泳： l利用蛋白质等两性电解质具有等电点，在利用蛋白质等两性电解质具有等电点，在等电点等电点pH值值 下呈电中性下呈电中性，从而不发生泳动特点而进行的电泳分离。，从而不发生泳动特点而进行的电泳分离。 l在电泳设备中首先需在电泳设备中首先需调配连续的调配连续的pH梯度梯度，然后使蛋白，然后使蛋白 质在电场作用下泳动到与各自等电点相等的质在电场作用下泳动到与各自等电点相等的pH值区域值区域 而不再

40、继续泳动，形成具有不同等电点的蛋白质区带。而不再继续泳动，形成具有不同等电点的蛋白质区带。 l调配稳定的连续调配稳定的连续pH梯度一般采用梯度一般采用氨基酸混合物或氨基氨基酸混合物或氨基 酸聚合羧酸的缓冲液酸聚合羧酸的缓冲液。如已经商业化载体。如已经商业化载体Ampholine为为 数百种组分的混合物，各组分具有不同等电点，一般有数百种组分的混合物，各组分具有不同等电点，一般有 pH46、pH810、pH911 3种种pH梯度范围供选择。梯度范围供选择。 酶的分离与纯化52 (3)连续凝胶电泳：连续凝胶电泳： 连续凝胶电泳实质上是聚丙烯酰胺凝胶垂直平连续凝胶电泳实质上是聚丙烯酰胺凝胶垂直平 板

41、电泳的发展，实现了在批次内连续将各个电板电泳的发展，实现了在批次内连续将各个电 泳区带分离回收，并可进行多批次分离操作。泳区带分离回收，并可进行多批次分离操作。 在电场作用下，电泳形成的区带依次连续走出在电场作用下，电泳形成的区带依次连续走出 凝胶并进行洗脱、收集，达到将各组分分离回凝胶并进行洗脱、收集，达到将各组分分离回 收的目的；收的目的； 酶的分离与纯化53 (4)连续流动电泳：连续流动电泳： l最早使用的连续流动电泳是在最早使用的连续流动电泳是在纸电泳纸电泳的基础上发展的基础上发展 起来的。以滤纸为载体，可以减少分离组分在流动起来的。以滤纸为载体，可以减少分离组分在流动 的缓冲液中的自

42、由扩散。将滤纸的上端插入电泳液的缓冲液中的自由扩散。将滤纸的上端插入电泳液 槽中，槽中，依靠毛细管虹吸作用和重力作用依靠毛细管虹吸作用和重力作用，电泳液沿，电泳液沿 着纸面向下均匀流动，在垂直于电泳缓冲液流动方着纸面向下均匀流动，在垂直于电泳缓冲液流动方 向施加电场，即在滤纸的两个侧边上与电极接触，向施加电场，即在滤纸的两个侧边上与电极接触， 将欲分离的样品以定点方式流加在滤纸上，加样点将欲分离的样品以定点方式流加在滤纸上，加样点 的位置需根据各组分的电泳行为确定。在电场作用的位置需根据各组分的电泳行为确定。在电场作用 下带有不同电荷的组分随着电泳缓冲液向前流动的下带有不同电荷的组分随着电泳缓

43、冲液向前流动的 同时而向不同的电极方向迁移。同时而向不同的电极方向迁移。 酶的分离与纯化54 (5)无载体连续流动电泳：无载体连续流动电泳： 又称为连续自由流动电泳，实质上与连续流动载体电泳又称为连续自由流动电泳，实质上与连续流动载体电泳 类似，只是不使用载体，而使用两张塑料板，在它们之类似，只是不使用载体，而使用两张塑料板，在它们之 间形成间形成0.50.8mm的间隙作为电泳槽，使电泳缓冲液的间隙作为电泳槽，使电泳缓冲液 从下到上平行流过电泳槽，依靠表面张力减少液体内部从下到上平行流过电泳槽，依靠表面张力减少液体内部 的流动性，待分离样品从下端某一点连续加入，在垂直的流动性，待分离样品从下端

44、某一点连续加入，在垂直 于电泳缓冲液流动方向上的电场作用下，带有不同电荷于电泳缓冲液流动方向上的电场作用下，带有不同电荷 的各个组分分别向不同的电极方向迁移，在电泳槽的末的各个组分分别向不同的电极方向迁移，在电泳槽的末 端，将流出的电泳缓冲液分割，再分别检测、收集，即端，将流出的电泳缓冲液分割，再分别检测、收集，即 可获得分离的各个组分。可获得分离的各个组分。 酶的分离与纯化55 u多孔膜自由流动电泳示意图多孔膜自由流动电泳示意图 利用利用多孔膜多孔膜将电泳槽分离成多个小池，在电场作用下将电泳槽分离成多个小池，在电场作用下 ，电泳分离的物质可透过膜在小池之间迁移，在各小，电泳分离的物质可透过膜

45、在小池之间迁移，在各小 池流动的电泳缓冲液不仅可起到带走电泳产生的热量池流动的电泳缓冲液不仅可起到带走电泳产生的热量 的作用，同时也可收集电泳产生的不同区带，从而达的作用，同时也可收集电泳产生的不同区带，从而达 到分离的目的。到分离的目的。 酶的分离与纯化56 u聚焦色谱聚焦色谱 l原理：原理： 当用特种的缓冲液滴定和淋洗填装在色谱柱中的特当用特种的缓冲液滴定和淋洗填装在色谱柱中的特 种多缓冲交换剂时，随着这种缓冲液的扩展，会在色谱种多缓冲交换剂时，随着这种缓冲液的扩展，会在色谱 柱中自上而下地建立起连续的柱中自上而下地建立起连续的pH梯度梯度，将待纯化样品，将待纯化样品 加入该色谱柱，其中的

46、蛋白质组分就将随着多缓冲液的加入该色谱柱，其中的蛋白质组分就将随着多缓冲液的 扩展按各自的等电点聚焦于相应的扩展按各自的等电点聚焦于相应的pH值区段并随扩展值区段并随扩展 过程中过程中pH梯度的逐渐下降，最后分别从色谱柱先后流梯度的逐渐下降，最后分别从色谱柱先后流 出，从而达到分离纯化的目的。出，从而达到分离纯化的目的。 兼有等电聚焦电泳的高分辨率和柱色谱简便的优点兼有等电聚焦电泳的高分辨率和柱色谱简便的优点 酶的分离与纯化57 亲和色谱亲和色谱 l原理：原理： 与酶发生结合的配基通过与酶发生结合的配基通过偶联反应偶联反应固定于色谱柱料载体上，固定于色谱柱料载体上， 当样品流过色谱柱时，目标酶

47、即迅速当样品流过色谱柱时，目标酶即迅速吸附吸附于其上，而杂蛋于其上，而杂蛋 白则在此过程中随缓冲液流出，而后可以通过在白则在此过程中随缓冲液流出，而后可以通过在洗脱液洗脱液中中 加入亲和力更强的配基，通过竞争作用使酶与配基解离，加入亲和力更强的配基，通过竞争作用使酶与配基解离， 也可通过改变条件促进色谱系统的解吸，选择性地将酶从也可通过改变条件促进色谱系统的解吸，选择性地将酶从 亲和吸附柱上分离下来。亲和吸附柱上分离下来。 l酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗 体、酶体、酶RNARNA与互补的与互补的RNARNA分子或片段、分子

48、或片段、RNARNA与互补的与互补的DNADNA分子分子 或片段或片段等之间，都是具专一而又可逆亲和力的生物分子对。等之间，都是具专一而又可逆亲和力的生物分子对。 酶的分离与纯化58 u亲和色谱原理及过程亲和色谱原理及过程 酶的分离与纯化59 选择性热变性法选择性热变性法 即在严格控制的条件下，将酶溶液迅速升温到某一温度即在严格控制的条件下，将酶溶液迅速升温到某一温度 并保温一定时间并保温一定时间(通过试验确定通过试验确定)，而后迅速冷却，而后迅速冷却，这样，这样 大量不耐热的杂蛋白就将变性析出，通过离心可除去，大量不耐热的杂蛋白就将变性析出，通过离心可除去， 而酶的总活力损失很少，同时比活力

49、大大上升。而酶的总活力损失很少，同时比活力大大上升。 u在酶溶液进行热处理前加入该酶的底物、辅酶、竞争性抑制剂、在酶溶液进行热处理前加入该酶的底物、辅酶、竞争性抑制剂、 保护巯基的还原剂等，以增大酶和杂蛋白问的耐热性差别。保护巯基的还原剂等，以增大酶和杂蛋白问的耐热性差别。 u严格控制溶液的严格控制溶液的pH值，因为不同值，因为不同pH值条件下酶的热稳定性是有值条件下酶的热稳定性是有 差别的，只有在一定的差别的，只有在一定的pH值条件下，才可能使操作具有较好的值条件下，才可能使操作具有较好的 重现性，尤其是在样品溶液有蛋白酶污染的情况下，应用此法时重现性，尤其是在样品溶液有蛋白酶污染的情况下，

50、应用此法时 应特别谨慎。应特别谨慎。 u胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶 酶的分离与纯化60 选择性酸碱变性法选择性酸碱变性法 u如果在一定温度下，目标酶表现出较强的耐酸性如果在一定温度下，目标酶表现出较强的耐酸性 或耐碱性，而这一条件对大多数蛋白质是不稳定或耐碱性，而这一条件对大多数蛋白质是不稳定 的，那么可以将溶液的的，那么可以将溶液的pH值严格控制在一定范值严格控制在一定范 围内并处理一定时间，同样可达到一定的纯化效围内并处理一定时间，同样可达到一定的纯化效 果。果。 u与选择性热变性相比，酸碱变性应用得不多，主与选择性热变性相比，酸碱变性应用得不多，主 要原

51、因可能在于操作较为复杂，条件不易控制，要原因可能在于操作较为复杂，条件不易控制， 而且纯化效果较差。而且纯化效果较差。 酶的分离与纯化61 表面变性法表面变性法 l利用酶溶液和惰性液体利用酶溶液和惰性液体(三氯甲烷三氯甲烷)混合振荡，造成选择性表面变混合振荡，造成选择性表面变 性性，振荡处理后混合液通常分为三层：上层为未变性蛋白质，中，振荡处理后混合液通常分为三层：上层为未变性蛋白质，中 间层为乳浊状变性蛋白质下层为三氯甲烷。间层为乳浊状变性蛋白质下层为三氯甲烷。 l利用泡沫形成也可达到选择性表面变性的目的。利用泡沫形成也可达到选择性表面变性的目的。 u应用表面变性法时需控制的因素很多，除了泡沫大小以及泡沫形应用表面变性法时需控制的因素很多，除了泡沫大小以及泡沫形 成的速度外，成的速度外，pH值和温度也十分重要。值和温度也十分重要。 u和酸碱变性一样和酸碱变性一样，它的应用面远不如选择性热变性。，它的应用面远不如选择性热变性。 过氧化氢酶、醇脱氢酶过氧化氢酶、醇脱氢酶和和-淀粉酶淀粉酶 通通氯气氯气到到磷酸核糖变位酶磷酸核糖变位酶和和核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶的溶液中，的溶液中， 可使磷酸核糖变位酶表面变性而纯化核苷磷酸化酶。可使磷酸核糖变位酶表面变性而纯化核苷磷酸化酶。 酶的分离与纯化62 5 5、酶的精制、酶的精制 l一、酶的