12食品中转基因成分的检验

1、食品中转基因成分的检验食品中转基因成分的检验 掌握掌握： 转基因食品的定义及其特征转基因食品的定义及其特征 定性、定量定性、定量PCR原理原理 基因芯片技术的定义及原理基因芯片技术的定义及原理 熟悉：熟悉： PCR技术检测转基因食品中外源性技术检测转基因食品中外源性DNA 的方法种类、样品前处理及优缺点的方法种类、样品前处理及优缺点 转基因食品中外源基因表达产物的检测转基因食品中外源基因表达产物的检测 方法及其局限性方法及其局限性 了解：了解： 基因芯片技术在转基因食品检验中的应用基因芯片技术在转基因食品检验中的应用 v “转基因转基因”是指利用分子生物学是指利用分子生物学 手段将外源性基因转

2、移到某种特定手段将外源性基因转移到某种特定 生物体中，使其生物性状或机能发生物体中，使其生物性状或机能发 生部分改变。生部分改变。 v转基因食品转基因食品就是以转基因生物体就是以转基因生物体 直接作为食品或以其为原料加工生直接作为食品或以其为原料加工生 产的食品产的食品 。 转基因食品（转基因食品（GMF）的定义）的定义 Genetically Modified Foods 转基因技术的基本步骤转基因技术的基本步骤 1. 辨认能体现所期望特征的目辨认能体现所期望特征的目 的基因代码，才可能从具有的基因代码，才可能从具有 该基因的天然活体中分离。该基因的天然活体中分离。 2.DNADNA的分离。

3、利用特殊的剪切的分离。利用特殊的剪切 酶。在特定位点上将供体的酶。在特定位点上将供体的DNADNA 分裂成含有目的基因的片段，分裂成含有目的基因的片段， 然后分离、纯化。然后分离、纯化。 3.3.利用载体将目的基因转移，利用载体将目的基因转移， 而其中典型的载体是由细菌或而其中典型的载体是由细菌或 病毒的病毒的DNADNA环型片段组成的环型片段组成的 4.4.目的基因的扩大培养及嫁入目的基因的扩大培养及嫁入 寄主细胞寄主细胞 5.5.选择性的标记基因选择性的标记基因 6.为控制基因表达而必需的为控制基因表达而必需的DNADNA 序列（启动子、终止子的序列（启动子、终止子的DNADNA序序 列必

4、须结合其中）列必须结合其中） 7.7.筛选和繁殖。经过转基因的筛选和繁殖。经过转基因的 寄主细胞必须经过严格筛选、寄主细胞必须经过严格筛选、 测试才能用于食品生产。测试才能用于食品生产。 目前上市的转基因食品目前上市的转基因食品 抗除草剂基因大豆抗除草剂基因大豆 抗虫基因玉米抗虫基因玉米 抗病毒基因油菜抗病毒基因油菜 抗病毒土豆抗病毒土豆 抗软化基因西红柿抗软化基因西红柿 转抗虫基因棉花转抗虫基因棉花 BT（苏云金芽胞杆菌）玉米（苏云金芽胞杆菌）玉米 苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌 产生毒害剂的基因产生毒害剂的基因 除害剂基因与质粒结合除害剂基因与质粒结合 BT 玉米玉米 含转基因的幼苗含转基因

5、的幼苗 植物细胞与植物细胞与重组基因重组基因 重组基因在细菌中重组基因在细菌中 细菌细菌共同培养共同培养 培养扩增细菌培养扩增细菌 基因重组基因重组 质粒质粒 v细菌细胞内一种自我复制的环状双链细菌细胞内一种自我复制的环状双链 DNA分子，存在于细胞质中分子，存在于细胞质中 v能稳定地独立存在于染色体外，并传能稳定地独立存在于染色体外，并传 递到子代，一般不整合到宿主染色体递到子代，一般不整合到宿主染色体 上。上。 v现在常用的质粒大多数是经过改造或现在常用的质粒大多数是经过改造或 人工构建的，常含抗生素抗性基因人工构建的，常含抗生素抗性基因， 是重组是重组DNA技术中重要的工具。技术中重要的

6、工具。 转基因食品的优势转基因食品的优势 增加作物单位面积产量增加作物单位面积产量 降低生产成本降低生产成本 增强作物抗虫害、抗病毒能力增强作物抗虫害、抗病毒能力 提高农产品的耐贮性，延长保鲜期提高农产品的耐贮性，延长保鲜期 摆脱季节、气候的影响，四季低成本供应摆脱季节、气候的影响，四季低成本供应 食品的品质和营养价值提高食品的品质和营养价值提高 富含富含 胡萝卜素的转基因胡萝卜素的转基因“金色水稻金色水稻” 转基因食品安全性争论转基因食品安全性争论 v赞同的人：赞同的人：认为该项技术及其产品认为该项技术及其产品 能大大提高人们的生活水平能大大提高人们的生活水平 v怀疑的人：怀疑的人：认为它走

7、得认为它走得“太快太快”了，了， 在现实生活中可能会产生副作用在现实生活中可能会产生副作用 v目前对转基因植物的安全性评价主目前对转基因植物的安全性评价主 要集中在两个方面，要集中在两个方面，一个是环境安一个是环境安 全性，另一个是食品安全性全性，另一个是食品安全性。 v英国英国“普兹台事件普兹台事件”：1998年，英国罗伊特研究所年，英国罗伊特研究所 普兹台教授说他的实验证明，幼鼠食用转基因土豆普兹台教授说他的实验证明，幼鼠食用转基因土豆 会使内脏和免疫系统受损。会使内脏和免疫系统受损。 转基因安全事件转基因安全事件 v美国的美国的“斑蝶事件斑蝶事件”：1999年美国康乃尔大学副教年美国康乃

8、尔大学副教 授约翰授约翰罗西在罗西在自然自然上发表文章说，一种转基因上发表文章说，一种转基因 玉米可产生杀死害虫的花粉，而身为益虫的一种美玉米可产生杀死害虫的花粉，而身为益虫的一种美 州大蝴蝶食用了这种转基因玉米花粉后有州大蝴蝶食用了这种转基因玉米花粉后有44死亡。死亡。 转基因安全事件转基因安全事件 过敏反应问题过敏反应问题：对于一种食物过敏的人有时还会：对于一种食物过敏的人有时还会 对一种以前他们不过敏的食物产生过敏对一种以前他们不过敏的食物产生过敏 比如：科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小比如：科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小 麦和贝类动物的基因中，蛋白质也随基因加了进去麦和贝

9、类动物的基因中，蛋白质也随基因加了进去 ，那么，以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、，那么，以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、 小麦和贝类食品过敏。小麦和贝类食品过敏。 营养问题营养问题：科学家们认为外来基因会以一种人们目：科学家们认为外来基因会以一种人们目 前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分。前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分。 对抗生素的抵抗作用对抗生素的抵抗作用：当科学家把一：当科学家把一 个外来基因加入到植物或细菌中去，这个外来基因加入到植物或细菌中去，这 个基因会与别的基因连接在一起。人们个基因会与别的基因连接在一起。人们 在服用了这种改良食物后，产生抗药性在服用了这种改良

10、食物后，产生抗药性 对环境的威胁对环境的威胁：不在改良范围之内的：不在改良范围之内的 其它物种有可能成为改良物种的受害者其它物种有可能成为改良物种的受害者 技术特征技术特征 v利用载体系统（细菌质粒、病毒的环利用载体系统（细菌质粒、病毒的环 形基因）的重组形基因）的重组DNA技术技术 v利用物理、化学和生物学等方法将重利用物理、化学和生物学等方法将重 组组DNA导入有机体的技术导入有机体的技术 转基因食品的特征转基因食品的特征 显微注射、基因枪等显微注射、基因枪等 农杆菌介导转化法农杆菌介导转化法 转基因食品的特征转基因食品的特征 产品特征产品特征 v具有食品或食品添加剂的特征具有食品或食品添

11、加剂的特征 v产品的基因组构成发生了改变，并存在产品的基因组构成发生了改变，并存在 外源外源DNA（基因重组体构成元件）（基因重组体构成元件） v产品中存在外源产品中存在外源DNA表达产物及其生表达产物及其生 物活性物活性 v产品具有基因工程所设计的性状和功能产品具有基因工程所设计的性状和功能 基因重组体构成元件基因重组体构成元件 v载体载体 v目的基因（定义目的基因（定义P184） 病毒衣壳蛋白基因病毒衣壳蛋白基因 病毒卫星病毒卫星RNA 病毒复制酶基因病毒复制酶基因 苏云金杆菌杀虫蛋白基因苏云金杆菌杀虫蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂基因 植物凝集素基因等植物凝集素基因等 v调控元件

12、调控元件 启动子（花椰菜花叶病毒的启动子（花椰菜花叶病毒的35S启动子等）启动子等） 终止子（花椰菜花叶病毒的终止子（花椰菜花叶病毒的35S终止子等）终止子等） v标记基因和报告基因标记基因和报告基因 标记基因：已知效应的基因，能够使标记基因：已知效应的基因，能够使 个体具备特定的特征并且通过生理学、个体具备特定的特征并且通过生理学、 形态学、生物化学或分子生物学检测形态学、生物化学或分子生物学检测 能够发现其存在的基因。能够发现其存在的基因。 基因重组体构成元件基因重组体构成元件 标记基因的作用标记基因的作用 是一种已知功能或已知序列的基因，是一种已知功能或已知序列的基因， 能够起着特异性标

13、记的作用能够起着特异性标记的作用 重组重组DNA载体的重要标记，用来检载体的重要标记，用来检 验目的基因转化成功与否验目的基因转化成功与否 检测目的基因在细胞中的定位检测目的基因在细胞中的定位 抗生素抗性基因、除草剂抗性基因抗生素抗性基因、除草剂抗性基因 n目的基因是需要表达的基因，标记目的基因是需要表达的基因，标记 基因是有一定特点的基因基因是有一定特点的基因 标记基因与目的基因的区别标记基因与目的基因的区别 大肠杆菌大肠杆菌的某种的某种质粒质粒具有具有青霉素抗性基因青霉素抗性基因， 当这种质粒与目的基因组合在一起形成重当这种质粒与目的基因组合在一起形成重 组质粒，并被转入受体细胞后，就可以

14、根组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根 据受体是否具有青霉素抗性来判断受体细据受体是否具有青霉素抗性来判断受体细 胞是否获得了目的基因。胞是否获得了目的基因。 然后，选择含有青霉素的培养基然后，选择含有青霉素的培养基 来培养受体细胞，能够在培养基来培养受体细胞，能够在培养基 中存活下来的受体细胞就可以认中存活下来的受体细胞就可以认 为是成功的导入了外源为是成功的导入了外源DNA，标，标 记基因就起作用了记基因就起作用了 报告基因与标记基因的异同报告基因与标记基因的异同 n作用与标记基因相同作用与标记基因相同 n标记基因的缺陷：标记基因的缺陷： l检测慢（蛋白酶作用需要时间）检测慢（蛋白酶作用需

15、要时间） l依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂） n而报告基因则是指其编码产物能够被快而报告基因则是指其编码产物能够被快 速测定、且不依赖于外界压力的一类基速测定、且不依赖于外界压力的一类基 因。因。 理想的报告基因具备如下要求理想的报告基因具备如下要求 n受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性 n它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞 n具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检 测特性测特性 常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因常用的报告基因有氯

16、霉素乙酰转移酶基因 （cat）、荧光素酶基因（）、荧光素酶基因（luc）、）、-葡萄糖苷葡萄糖苷 酸酶基因（酸酶基因（gus）等）等 氯霉素乙酰基转移酶氯霉素乙酰基转移酶(CAT)： n可催化乙酰可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉的乙酰基转移到氯霉 素素3羟基，而使氯霉素解毒羟基，而使氯霉素解毒 n用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测 定定(ELISA)检测其活性，也可进行蛋检测其活性，也可进行蛋 白质印迹白质印迹(Westernblotting)和免疫组和免疫组 织化学分析织化学分析 荧光素酶荧光素酶 n催化不同底物氧化发光的一类酶，催化不同底物氧化发光的一类酶，

17、 哺乳细胞无内源性荧光素酶。哺乳细胞无内源性荧光素酶。 n最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、 萤火虫荧光素酶。萤火虫荧光素酶。 n用荧光比色计即可检测酶活性。用荧光比色计即可检测酶活性。 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 n由大肠杆菌基因编码，可催化半乳糖苷由大肠杆菌基因编码，可催化半乳糖苷 水解水解 n最大优势是易于用免疫组织化学法观测最大优势是易于用免疫组织化学法观测 其原位表达，是最常用的监测转染率的其原位表达，是最常用的监测转染率的 报道基因之一报道基因之一 n以邻以邻硝基苯硝基苯D半乳吡喃糖苷半乳吡喃糖苷 (ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶为底物可用标准的比色

18、法检测酶 活性活性 GMFGMF成分检测成分检测 外源基因的检测外源基因的检测 基因基因 芯片芯片 Southern 杂交杂交 PCR 反转录反转录 RT-PCRRT-PCR法法 定量定量PCRPCRPCR-ELISA法法 定量竞争性定量竞争性 QC-PCRQC-PCR法法 实时定量实时定量 荧光荧光PCRPCR法法 定性定性PCRPCR 外源蛋白质的检测外源蛋白质的检测 酶联酶联 免疫免疫 吸附吸附 试验试验 “侧流侧流” 型免疫型免疫 测定测定 试纸试纸 条法条法 蛋白蛋白 芯片芯片 蛋白蛋白 质印质印 迹法迹法 其它技术其它技术 优势优势: : u 除蛋白芯片法外。快速除蛋白芯片法外。快

19、速, ,具有一具有一 定的灵敏度定的灵敏度, ,也能进行半定量也能进行半定量 u尤其是试纸条法尤其是试纸条法, ,不需特殊仪器设不需特殊仪器设 备备, ,适用于现场检验或初筛适用于现场检验或初筛 外源蛋白质检测方法外源蛋白质检测方法 v局限性局限性: : 1. 1.由于抗原抗体反应的专一性由于抗原抗体反应的专一性, ,每每 种转基因产品都要开发和建立专种转基因产品都要开发和建立专 门的检测试剂和方法门的检测试剂和方法, ,而转基因产而转基因产 品种类繁多品种类繁多, ,要建立所有转基因产要建立所有转基因产 品的蛋白质检测法工作量很大。品的蛋白质检测法工作量很大。 2.2.只能定性和半定量检测只

20、能定性和半定量检测 外源蛋白质检测方法外源蛋白质检测方法 3.3.对于加工过的转基因食品对于加工过的转基因食品, ,其蛋其蛋 白质很容易被破坏白质很容易被破坏, ,从而影响检测从而影响检测 结果的准确性。结果的准确性。 4.4.有些插入基因根本不表达或表达有些插入基因根本不表达或表达 量很低，无法检测。量很低，无法检测。 外源蛋白质检测方法外源蛋白质检测方法 载体载体 目的基因目的基因 调控元件调控元件（启动子、终止子、增强子）（启动子、终止子、增强子） 标记基因标记基因 报告基因报告基因 PCR检测外源检测外源DNA 外源外源DNA 根据检测目的和检测结果特异性水平的不同，外根据检测目的和检

21、测结果特异性水平的不同，外 源源DNA的检测方法有：的检测方法有： v初筛试验：对通用元件的检测初筛试验：对通用元件的检测 局限性：只能鉴别产品是否含有基因重组体，不局限性：只能鉴别产品是否含有基因重组体，不 能鉴定转基因产品的种类能鉴定转基因产品的种类 v基因特异性试验基因特异性试验 能检测不同的目的基因、标记基因或报告基因，能检测不同的目的基因、标记基因或报告基因， 区别不同的植物品系区别不同的植物品系 PCR检测外源检测外源DNA v组成结构特异性试验组成结构特异性试验 q检测目的基因与调控基因连接处检测目的基因与调控基因连接处 的核苷酸序列区段的核苷酸序列区段 q区别某类植物的各种转基

22、因株系区别某类植物的各种转基因株系 v插入位点构成特异性试验插入位点构成特异性试验 q区别同一插入序列在基因组中的区别同一插入序列在基因组中的 不同重组状态不同重组状态 o聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）是体外酶促合成特异）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，片段的一种方法， 由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成 一个周期，循环进行，使目的一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。 o步骤步骤 DNA的提取的提取 DNA纯化纯化 设计并合成引物设计并合成引物

23、探针制备探针制备 PCR检测检测 PCR检测外源检测外源DNA 定性、定量定性、定量 v植物细胞中植物细胞中DNA主要存在于细胞核内主要存在于细胞核内 v细胞质中的细胞质中的DNA主要存在于线粒体和叶绿体中主要存在于线粒体和叶绿体中 v细胞内各种细胞内各种DNA总称为总总称为总DNA v进行转基因检测需要提取的是总进行转基因检测需要提取的是总DNA v95%以上的以上的DNA是与蛋白质结合的是与蛋白质结合的 DNA的提取和纯化的提取和纯化 基本原理是：从样品中释放基本原理是：从样品中释放DNA，去除其他杂质：，去除其他杂质： 去污剂或有机试剂破坏细胞膜，释放游离去污剂或有机试剂破坏细胞膜，释放

24、游离DNA 蛋白质：蛋白酶或有机试剂去除；蛋白质：蛋白酶或有机试剂去除； 多糖（如果胶、纤维素、淀粉等），以相应的酶多糖（如果胶、纤维素、淀粉等），以相应的酶 或有机溶剂（或有机溶剂（CTAB/氯仿等）去除氯仿等）去除 脂类：酶或溶剂（如正己烷）去除脂类：酶或溶剂（如正己烷）去除 RNA：RNA酶去除酶去除 盐类（提取盐类（提取/裂解缓冲液或沉淀液的残留物）裂解缓冲液或沉淀液的残留物） DNA的提取和纯化的提取和纯化 v沉淀法沉淀法：乙醇和异丙醇等沉淀乙醇和异丙醇等沉淀DNA v固体介质吸附法固体介质吸附法：采用阴离子交换树脂、：采用阴离子交换树脂、 硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附硅石或玻璃珠

25、、硅藻土、膜等吸附DNA。 DNA的提取和纯化方法的提取和纯化方法 植物总植物总DNA的提取方法的提取方法 苯酚氯仿苯酚氯仿 法法 CTAB法法 SDS法法 二氧化硅法二氧化硅法 胍盐胍盐 vDNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂 vCTAB溶解细胞膜，使蛋白质变性，与溶解细胞膜，使蛋白质变性，与DNA形成复形成复 合物合物 vCTAB与与DNA的复合物在高盐溶液中可溶的复合物在高盐溶液中可溶，而蛋白，而蛋白 质、多糖、多酚溶解性降低会沉淀质、多糖、多酚溶解性降低会沉淀 CTAB法提取和纯化法提取和纯化DNA原理原理 十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵

26、(CTAB) vCTAB与与DNA的复合物低盐溶液中沉的复合物低盐溶液中沉 淀淀；而多糖、色素等不沉淀；而多糖、色素等不沉淀 v使沉淀物溶于高盐溶液，加入乙醇和使沉淀物溶于高盐溶液，加入乙醇和 异丙醇沉淀异丙醇沉淀DNA CTAB法提取和纯化法提取和纯化DNA原理原理 两个关键试剂：两个关键试剂： CTAB缓冲液缓冲液高盐溶液高盐溶液 CTAB沉淀液沉淀液低盐溶液低盐溶液 适合糖类和酚类含量较高的样品适合糖类和酚类含量较高的样品 加入加入CTAB缓冲液缓冲液 加入加入氯仿氯仿 反复颠倒反复颠倒 试管试管 离心离心 取上清取上清 加入加入 CTAB沉沉 淀液淀液 离心离心 取沉淀取沉淀 CTAB

27、法提取和纯化法提取和纯化DNA步骤步骤 CTAB法提取和纯化法提取和纯化DNA步骤步骤 加入高浓度加入高浓度NaCl溶液溶液 加入氯仿加入氯仿 离心、取上清液离心、取上清液 加入异丙醇加入异丙醇 离心、取沉淀离心、取沉淀 反复加入乙醇反复加入乙醇 离心、取沉淀离心、取沉淀 自然晾干自然晾干 去离子水或去离子水或TE 缓冲液溶解缓冲液溶解 提纯提纯DNA质量的检测质量的检测 电泳原理：电泳原理： DNA分子在高分子在高 于等电点的于等电点的PH 溶液中带负电溶液中带负电 荷，在电场中荷，在电场中 向正极移动。向正极移动。 其迁移速度与其迁移速度与 相对分子质量相对分子质量 的对数成反比的对数成反

28、比 。 260nm、280nm处测定吸光度处测定吸光度 A260nm/ A280nm在在1.61.9：纯度高，可用：纯度高，可用 A260nm/ A280nm1.6：蛋白质或溶剂污染：蛋白质或溶剂污染 A260nm/ A280nm1.9：RNA污染污染 提纯提纯DNA纯度的检测纯度的检测 用用RNA酶酶或或苯酚氯仿法苯酚氯仿法进一步纯化进一步纯化 PCR技术技术的原理的原理 PCR技术类似于技术类似于DNA的天然复制过程。的天然复制过程。 在适宜的条件下，人工合成寡核苷酸引物与模在适宜的条件下，人工合成寡核苷酸引物与模 板板DNA单链互补结合，在单链互补结合，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用

29、下，以四种脱氧核苷酸下，以四种脱氧核苷酸(dNTP) 为底物，不断为底物，不断 延伸，使被扩增的基因片断以几何倍数增长。延伸，使被扩增的基因片断以几何倍数增长。 定性定性PCR的检测方法的检测方法 变性退火延伸变性退火延伸 模板模板DNA的变性的变性：加热至：加热至93-95，模板，模板DNA 双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA离解成为单离解成为单 链；链； 模板模板DNA与引物的退火（复性）：与引物的退火（复性）：温度降至温度降至 55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配单链的互补序列配 对结合；对结合； PCR过程的基本步骤过程的基本步骤 引物的延伸

30、引物的延伸：温度升至：温度升至72左右，在左右，在 Taq DNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，合成一条与模板为反应原料，合成一条与模板DNA单单 链互补链。链互补链。 重复变性退火延伸三个过程，目重复变性退火延伸三个过程，目 的基因被扩增放大几百万倍。每个循的基因被扩增放大几百万倍。每个循 环需环需2-4min，整个，整个PCR反应需要反应需要2-3h。 PCR原理示意图原理示意图 PCR引物与模板结合示意图引物与模板结合示意图 v 模板、引物、酶、模板、引物、酶、dNTP和和Mg2+是是 PCR反应的五个重要因素，决定了反应的五个重要因素，决定了 PCR反应的成

31、败反应的成败。 模板模板DNA：抽提的：抽提的DNA溶液中含有溶液中含有 氯仿、乙醇等有机溶剂、氯仿、乙醇等有机溶剂、Taq酶抑酶抑 制剂和杂蛋白等会影响制剂和杂蛋白等会影响PCR扩增，扩增， 产生假阴性。产生假阴性。 PCR反应的主要因素反应的主要因素 引物：引物：PCR产物的特异性取决于引物与产物的特异性取决于引物与 模板模板DNA互补的程度，互补的程度，引物的设计和合引物的设计和合 成对成对PCR结果起着决定性作用结果起着决定性作用。 引物的设计方法：引物的设计方法： 参考文献报道常用的效果最佳的引物参考文献报道常用的效果最佳的引物 采用计算机软件，例如采用计算机软件，例如Permier

32、 Primer、 Oligo等。在软件的基础上辅以人工分析，等。在软件的基础上辅以人工分析， 以达到最佳效果。以达到最佳效果。 Taq DNA聚合酶：聚合酶： 是一种耐热的是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生聚合酶，由于发现于水生 栖热菌（栖热菌（Thermus aquaticus）内，故命名为）内，故命名为 Taq聚合酶，也称为聚合酶，也称为TaqDNA聚合酶聚合酶 其活力的高低决定了其活力的高低决定了PCR扩增是否成功扩增是否成功 最适温度很高（最适温度很高（79），使引物在高温下进），使引物在高温下进 行退火和延伸，增加了反应的特异性和扩增行退火和延伸，增加了反应的特异性和扩增 效率

33、。效率。 dNTP 三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写 N代表代表A、G、C、T等中的一种，是它等中的一种，是它 们的混合物们的混合物 在在PCR中起原料作用中起原料作用 浓度过低会降低浓度过低会降低PCR产物的产量；浓度产物的产量；浓度 过高会导致错配过高会导致错配 DNA聚合酶水解下来两个磷酸后把脱氧单磷聚合酶水解下来两个磷酸后把脱氧单磷 酸核苷酸连在酸核苷酸连在DNA模板链上模板链上 Mg2+浓度浓度 Mg2+是是Taq DNA聚合酶活性所必需聚合酶活性所必需的，直接的，直接 影响着酶的活性和可靠性影响着酶的活性和可靠性 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特浓度过

34、高，反应特异性降低，出现非特 异性扩增异性扩增 浓度过低会降低浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使聚合酶的活性，使 反应产物减少反应产物减少 DNA模板、引物和模板、引物和dNTP可与可与Mg2+结合，降结合，降 低低Mg2+实际浓度实际浓度 假阳性、假阴性假阳性、假阴性 引起假阳性现象的原因引起假阳性现象的原因 极微量的目标极微量的目标DNA污染都有可能出污染都有可能出 现扩增条带。现扩增条带。 引物设计不合适也会出现假阳性现象引物设计不合适也会出现假阳性现象 PCR检测常见问题检测常见问题 引起假阴性现象的原因引起假阴性现象的原因 v 模板中含有杂蛋白质，模板中含有杂蛋白质，Taq

35、酶抑制剂，酚、氯仿、酶抑制剂，酚、氯仿、 乙醇等有机溶剂乙醇等有机溶剂 v DNA量不足量不足 v Taq酶失活、酶活降低或量不足酶失活、酶活降低或量不足 v 引物设计不合理引物设计不合理 v 变性温度低，时间短变性温度低，时间短 v 退火温度不适合等等退火温度不适合等等 PCR检测常见问题检测常见问题 v非特异性扩增：引物与靶序非特异性扩增：引物与靶序 列不完全互补、或引物聚合列不完全互补、或引物聚合 形成二聚体形成二聚体 v涂抹带、片状带、地毯样带涂抹带、片状带、地毯样带 （Smear现象）。现象）。 v原因：酶过多或酶质量差，原因：酶过多或酶质量差， dNTP浓度过高，浓度过高，Mg2+

36、浓度浓度 过高，退火温度过低等。过高，退火温度过低等。 PCR检测常见问题检测常见问题 v DNA的提取纯化的提取纯化 设置阳性对照、阴性对照设置阳性对照、阴性对照 v 确定待测目标序列确定待测目标序列 v 引物设计引物设计 v PCR反应体系的构建反应体系的构建 v PCR扩增扩增 v 电泳及结果分析电泳及结果分析 转基因成分的转基因成分的PCR检测一般程序检测一般程序 n原理原理 通过通过PCR扩增和凝胶电泳分离可扩增和凝胶电泳分离可 得到大小为得到大小为170bp的的DNA片段，片段， 包括包括花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒CaMV35S 启动子和玉米基因组的启动子和玉米基因组的DNA序列

37、。序列。 PCR定性检测抗虫转基因玉米定性检测抗虫转基因玉米MON810品系品系 设计引物设计引物 n正向引物正向引物：玉米基因，：玉米基因，5-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CG- 3 n反向引物反向引物：CaMV35S启动子启动子 （GeneBank编号：编号：V000141， J02048），）， 5-TCC ATC TTT GGG ACC ACT GTC G- 3 注释：注释：GeneBank是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，汇是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，汇 集并注释了所有公开的核酸序列。集并注释了所有公开的核酸序列。 PCR反应体系的构

38、建反应体系的构建 试剂试剂终浓度终浓度加样体积加样体积/l 模板模板DNA10-50ng2 水水14.8 10PCR缓冲液（不含缓冲液（不含MgCl2）12.5 MgCl2溶液溶液2mmol/L2.0 dNTP溶液溶液0.4mmol/L1.0 正向引物正向引物0.5 mol/L1.25 反向引物反向引物0.5 mol/L1.25 Taq酶（酶（5IU/ml）1IU0.2 PCR扩增扩增 预变性预变性10min，95 20s， 95 扩增扩增40s， 64 40s， 72 循环数循环数40 最终延伸最终延伸3min， 72 电泳及结果分析电泳及结果分析 n方法：取方法：取PCR产物在含有溴化乙锭

39、的琼产物在含有溴化乙锭的琼 脂糖凝胶上进行电泳，用紫外灯或凝胶脂糖凝胶上进行电泳，用紫外灯或凝胶 成像系统观察并记录成像系统观察并记录PCR产物电泳条带。产物电泳条带。 n结果：结果： l阴性：无电泳条带阴性：无电泳条带 l阳性：有电泳条带阳性：有电泳条带 l待测样品待测样品 n有电泳条带：含转基因成分有电泳条带：含转基因成分 n无电泳条带：不含转基因成分无电泳条带：不含转基因成分 170bp M 1 2 3 4 原理原理 v特异性强、自动化程度高、不使用溴化乙锭、特异性强、自动化程度高、不使用溴化乙锭、 不污染环境等特点不污染环境等特点 v指在指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光反应体

40、系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整个信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标进程，最后通过标 准曲线（标准品）对未知模板进行定量分析的准曲线（标准品）对未知模板进行定量分析的 方法。方法。 v使用的化学物质：荧光探针和荧光染料使用的化学物质：荧光探针和荧光染料 实时荧光定量实时荧光定量PCR TaqMan荧光探针荧光探针 nPCR扩增时，加入一对引物，同时加入一个特异性扩增时，加入一对引物，同时加入一个特异性 的荧光探针。的荧光探针。 n该探针为一寡核苷酸，两端分别标记了一个报告荧该探针为一寡核苷酸，两端分别标记了一个报告荧 光基团和一个猝灭荧光基团。光基团和一个猝灭荧光基团。

41、n探针完整时，报告基团发射的荧光信号被猝灭基团探针完整时，报告基团发射的荧光信号被猝灭基团 吸收；吸收；PCR扩增时，扩增时，Taq酶的酶的5-3外切酶活性将探外切酶活性将探 针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离， 从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一 条条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信 号的累积与号的累积与PCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。 TaqMan 探针法探针法 原理图原理图 v荧光扩增曲线的三个阶段：荧光背景信号阶段荧光扩增曲线的三个阶段：荧光背景信号阶段 （基线期）（基线期） ，荧光信号指数扩增阶段（对数期）荧光信号指数扩增阶段（对数期）、 平台期。平台期。 v只有在荧光信号指数扩增阶段，只有在荧光信号指数扩增阶段，