刘伟氧化应激抑制IGF1神经保护作用的机制及对策的研究课件

1、氧化应激抑制氧化应激抑制IGF-1神经保护作用的机制神经保护作用的机制 及对策的研究及对策的研究 同同 济济 医医 院院: 刘刘 伟伟 导导 师师: 常立文常立文 教授教授 李维华李维华 教授教授 华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科 American Heart Association资助项目资助项目 Indiana Spinal Cord and Brain Injury Research Fund资助项目资助项目 背背 景景 大脑的缺氧缺血仍然是造成严重脑损伤的主要原因之一大脑的缺氧缺血仍然是造成严重脑损伤的主要原因之一 20%死亡，高达死亡，高达

2、40%幸存者遗留严重的神经系统后遗症幸存者遗留严重的神经系统后遗症 迄今仍无十分有效的临床手段能减轻脑损伤和改善预后迄今仍无十分有效的临床手段能减轻脑损伤和改善预后 由于新生脑组织不成熟，使其对缺氧缺血反应更为敏感由于新生脑组织不成熟，使其对缺氧缺血反应更为敏感 背背 景景 IGF-1可促进神经细胞可促进神经细胞生存、分化、增殖、突触生存、分化、增殖、突触 外伸已经髓鞘形成外伸已经髓鞘形成 然而若干瓶颈阻碍了然而若干瓶颈阻碍了IGF-1进一步试用于临床进一步试用于临床 在新生大鼠模型，即使在缺氧缺血发生后立即心腔内注在新生大鼠模型，即使在缺氧缺血发生后立即心腔内注 射大剂量射大剂量IGF-1，

3、脑损伤仅能减少，脑损伤仅能减少40%40%左右左右 缺氧缺血后延迟（缺氧缺血后延迟（6h以后）给予以后）给予IGF-1治疗效果不清楚治疗效果不清楚 IGF-1对脑和行为学发展的远期效果不明了对脑和行为学发展的远期效果不明了 背背 景景 我们前期研究发现缺氧缺血后我们前期研究发现缺氧缺血后24和和48h皮下注射皮下注射 IGF-1可显著减轻缺氧缺血诱导的不成熟鼠脑损可显著减轻缺氧缺血诱导的不成熟鼠脑损 伤，并在伤，并在2个月后明显改善它们的记忆和认知行个月后明显改善它们的记忆和认知行 为发展为发展（Zhong,J.Neurological Research,2009） 那么，这些新的发现提出一个

4、问题：那么，这些新的发现提出一个问题：？为什么为什么 在缺氧缺血后立即投与在缺氧缺血后立即投与IGF-1疗效不如延迟治疗疗效不如延迟治疗 明显明显 由于缺氧缺血后大量由于缺氧缺血后大量ROS的立即产生，我们猜想，正是的立即产生，我们猜想，正是 这种氧化应激状态诱导了神经细胞对这种氧化应激状态诱导了神经细胞对IGF-1的抵抗的抵抗 背背 景景 我们进一步考虑是否能够在加入我们进一步考虑是否能够在加入IGF-1之前加入一种抗之前加入一种抗 氧化剂，以恢复神经细胞对氧化剂，以恢复神经细胞对IGF-1的敏感性的敏感性 我室前期的研究证实，在缺氧缺血发生后，体外培养的我室前期的研究证实，在缺氧缺血发生后

5、，体外培养的 神经细胞会立即产生大量的神经细胞会立即产生大量的ROS（J.Zhong, W-H.Lee. Neurochemistry International.2007(51):398-404） 背背 景景 那么，这种抗氧化剂最好能满足以下条件：那么，这种抗氧化剂最好能满足以下条件： u本身没有毒副作用，不会对细胞造成新的损伤本身没有毒副作用，不会对细胞造成新的损伤 u能够很容易的进入细胞内，在胞内胞外均能发挥作用能够很容易的进入细胞内，在胞内胞外均能发挥作用 u具有良好的抗氧化功能，能够清除具有良好的抗氧化功能，能够清除ROS，消除缺氧缺血，消除缺氧缺血 发生后的氧化应激状态发生后的氧化

6、应激状态 u与与IGF-1有协同作用，能够恢复细胞对有协同作用，能够恢复细胞对IGF-1的反应性，的反应性， 增强增强IGF-1对缺氧缺血后细胞的保护作用对缺氧缺血后细胞的保护作用 目目 的的 通过建立新生大鼠神经元细胞氧化应激的模型通过建立新生大鼠神经元细胞氧化应激的模型 阐明氧化应激诱导神经细胞产生阐明氧化应激诱导神经细胞产生IGF-1抵抗的机制抵抗的机制 找到一种理想的抗氧化剂，联合应用能够在氧化应激状态下增找到一种理想的抗氧化剂，联合应用能够在氧化应激状态下增 强强IGF-1对神经细胞的保护作用对神经细胞的保护作用 第第 一一 部部 分分 氧化应激对氧化应激对IGF-1诱导不成熟大脑皮

7、层神诱导不成熟大脑皮层神 经细胞生存信号的影响经细胞生存信号的影响 实验分组实验分组 24h内的新生内的新生SD大鼠，取大脑皮层，分别培养神经元大鼠，取大脑皮层，分别培养神经元 细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞，并分别给予不细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞，并分别给予不 同的处理条件同的处理条件 、不同浓度的、不同浓度的H2O2处理组处理组 、不同浓度的、不同浓度的IGF-1处理组处理组 、不同浓度的、不同浓度的H2O2+IGF-1处理组处理组 和处理时间：和处理时间：45min、2hour和和4hour 材材 料料 和和 方方 法法 材材 料料 和和 方方 法法 LDH法检测细胞的死亡法检测

8、细胞的死亡 MTT法检测细胞的存活法检测细胞的存活 Western blot检测各种蛋白的表达检测各种蛋白的表达 数据统计数据统计 采用采用SPSS11.0软件进行方差分析、软件进行方差分析、检验检验 图图1-1,1-2 H2O2对神经元细胞、少突胶质细胞和对神经元细胞、少突胶质细胞和 星形胶质细胞星形胶质细胞LDH和和MTT的影响的影响 与少突胶质细胞和星形胶质细胞比较，与少突胶质细胞和星形胶质细胞比较，P0.01，n=8，结果重复，结果重复3次次 结结 果果 一、大脑皮层神经元细胞对氧化应激损伤异常一、大脑皮层神经元细胞对氧化应激损伤异常 敏感敏感 图图2-1,2-2 不同浓度不同浓度H2

9、O2对皮层神经元细胞对皮层神经元细胞LDH和和MTT 的影响的影响 n=4，结果重复，结果重复3次次 图图2-3 不同浓度不同浓度H2O2对皮层神经元细胞对皮层神经元细胞Caspase-3表达的表达的 影响影响 Caspase-3 Cleaved Caspase-3 H2O2(uM) 0 10 20 40 60 n=8，结果重复，结果重复3次次 二、二、H2O2对皮层神经元细胞的毒性作用呈对皮层神经元细胞的毒性作用呈 剂量依赖性剂量依赖性 结结 果果 图图3-1 不同浓度不同浓度IGF-1对皮层神经元细胞对皮层神经元细胞LDH的影响的影响 与未加与未加IGF-1组比较，组比较，P0.05，n=

10、8，结果重复，结果重复3次次 图图3-2 IGF-1对皮层神经元细胞对皮层神经元细胞Caspase-3表达的影响表达的影响 与未加与未加IGF-1组比较，组比较，P0.01，n=8，结果重复，结果重复3次次 Caspase-3 Cleaved Caspase-3 IGF-1(ng/ml) 0 25 结结 果果 三、三、IGF-1对皮层神经元细胞的凋亡具有对皮层神经元细胞的凋亡具有 保护作用保护作用 图图4-1,4-2 不同不同H2O2浓度下加入浓度下加入IGF-1对皮层神经元细胞对皮层神经元细胞 LDH和和MTT的影响的影响 n=4，结果重复，结果重复3次次 图图4-3 不同不同H2O2浓度下

11、加入浓度下加入IGF-1对皮层神经元细胞对皮层神经元细胞 Caspase-3表达的影响表达的影响 Caspase-3 Cleaved Caspase-3 H2O2(uM) 0 20 40 60 IGF-1(ng/ml) 0 25 0 25 0 25 0 25 与未加与未加IGF-1组比较，组比较，P0.01，n=8，结果重复，结果重复3次次 结结 果果 四、高浓度四、高浓度H2O2能够抑制能够抑制IGF-1对皮层神对皮层神 经元细胞的保护作用，即经元细胞的保护作用，即H2O2诱导神诱导神 经元细胞的经元细胞的IGF-1抵抗抵抗 图图5 氧化应激状态下，加入不同浓度氧化应激状态下，加入不同浓度I

12、GF-1对皮层神经元对皮层神经元 细胞细胞LDH的影响的影响 与未加与未加IGF-1组比较，组比较，P0.05，P0.01，n=4，结果重复，结果重复3次次 结结 果果 五、提高五、提高IGF-1的浓度并不能克服的浓度并不能克服H2O2诱诱 导的皮层神经元细胞导的皮层神经元细胞IGF-1抵抗抵抗 图图6 高浓度高浓度H2O2阻断阻断IGF-1对皮层神经元细胞对皮层神经元细胞P- Akt(ser473)表达的影响表达的影响 P-Akt(ser473) Akt H2O2(uM) 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 IGF-1(ng/ml) 0 0 0 0 0 25 25 25

13、25 25 n=8，结果重复，结果重复3次次 结结 果果 六、六、IGF-1通过激活皮层神经元细胞生存信通过激活皮层神经元细胞生存信 号通路号通路P-Akt(Ser473)，但是这一过程，但是这一过程 能被高浓度的能被高浓度的H2O2阻遏阻遏 氧化 应激 ROS Akt JNK2 P-FOXO3(Thr32) P-FOXO3(Serr253) FOXO3FOXO3激活 细胞凋亡 IGFIR P53 IGF-1生存信号 第第 二二 部部 分分 丙酮酸钠恢复氧化应激状态下丙酮酸钠恢复氧化应激状态下 神经细胞对神经细胞对IGF-1信号的敏感性信号的敏感性 实验分组实验分组 同第一部分同第一部分 材材

14、 料料 和和 方方 法法 Western-blot检测各种蛋白的表达检测各种蛋白的表达 方法方法 LDH法检测细胞的死亡法检测细胞的死亡 采用采用SPSS11.0软件进行方差分析、软件进行方差分析、检验检验 数据统计数据统计 图图7 氧化应激状态下，氧化应激状态下，IGF-1和丙酮酸钠对皮层神经和丙酮酸钠对皮层神经 元细胞元细胞P-Akt(ser473)表达的影响表达的影响 P-Akt(ser473) Akt H2O2(uM) 0 0 0 0 60 60 60 60 80 80 80 80 与前三种处理因素比较与前三种处理因素比较,P0.01 ，n=8，结果重复，结果重复3次次 IGF-1(n

15、g/ml) 0 25 0 25 0 25 0 25 0 25 0 25 Sodium Pyruvate(mM) 0 0 2 2 0 0 2 2 0 0 2 2 结结 果果 七、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能使大脑皮七、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能使大脑皮 层神经细胞恢复对层神经细胞恢复对IGF-1的敏感性的敏感性 图图8 氧化应激状态下，丙酮酸钠对皮层神经氧化应激状态下，丙酮酸钠对皮层神经 元细胞元细胞LDH和活化和活化Caspase-3表达的影响表达的影响 Caspase-3 Cleaved Caspase-3 H2O2(uM) 80 80 80 80 IGF-1(ng/ml) 0 25 0

16、25 Sodium Pyruvate(mM) 0 0 2 2 在未加在未加H2O2组，与未处理组比较，组，与未处理组比较，P0.05， 80uM H2O2组，与处理组比较，组，与处理组比较， P0.01 ， n=4，结果重复，结果重复3次次 与未处理组比较与未处理组比较,P0.01 ，n=8，结果重复，结果重复3次次 结结 果果 八、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能够减少大脑八、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能够减少大脑 皮层神经细胞的死亡皮层神经细胞的死亡 小小 结结 丙酮酸钠能够有效清除丙酮酸钠能够有效清除ROS，恢复，恢复AKT自身活性以及自身活性以及 AKT对对IGF-1的反应性，从而发挥其减少神经细胞凋亡的反应性，从而发挥其减少神经细胞凋亡 的作