不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布(一).doc

1、不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布 (一)作者：杨维青石磊尹晓琳李心晖谢轶程曦曾蔚殷长甫贾文祥【关键词】铜绿假单胞菌； ,第一类整合子； ,整合子相关基因盒摘要：目的对石家庄、昆明两地分离的铜绿假单胞菌临床菌株进行第一类整合子的分布及整合子相关基因盒携带率的比较分析，探讨第一类整合子在两地菌株分布的差别。 方法采用 PCR方法筛选检测 64 株石家庄、昆明两地临床分离的铜绿假单胞菌第一类整合子和及其所携带的整合子相关基因盒。结果 64 株铜绿假单胞菌临床菌中共有 43 株为第一类整合子阳性菌 (阳性率 672%)；其中石家庄菌株和昆明菌株阳性率分别为 714%和 643%

2、，两地铜绿假单胞菌第一类整合子阳性率无显著性差异。第一类整合子阳性铜绿假单胞菌中，石家庄菌株和昆明菌株携带一类整合子相关基因盒的阳性率分别为 800%和 38%，两地第一类整合子阳性菌中整合子相关基因盒的携带率具有显著性差异 (P001)；两地菌株携带的基因盒大小不同。结论第一类整合子在铜绿假单胞菌临床菌株中广泛分布，环境的选择压力影响细菌整合子相关基因盒的分布。关键词：铜绿假单胞菌；第一类整合子；整合子相关基因盒Distributionandidentificationofclass1integronsandintegratedgenecassettesABSTRACTObjectiveTh

3、edistributionandcharacterizationoftheclass1integrons(int1)andintegratedgenecassettesamongPseudonmonasaeruginosastrainsfromdifferentgeographicregionswereinvestigated.Methods64clinicalstrainsofP.aeruginosawereisolatedfromShijiazhuangandKunminghospitals,China.Thepresenceandgeneticcontentofint1andintegr

4、atedgenecassetteswereexaminedbyPCRmethod.ResultsTheincidenceofint1inthe64clinicalisolatesofP.aeruginosawas672%(43/64),inwhichtheincidencesofint1carriedbythestrainsfromShijiazhuangandKunmingwere714%and643%respectively.Of43clinicalisolatesharboringintI1,27carriedtheintegratedgenecassttesand16werefound

5、tolackintegratedgenecassttes.Theincidencesofgenecassttewere800%and384%inint1positivestrainsfromShijiazhuangandKunming.ConclusionResultsrevealedthatintegronstructureswerewidespreadinclinicalisolatesofP.aeruginosa.Theantibioticselectivepressuresplayasignificantroleinthedistributionofintegratedgenecass

6、ettesinbacteria.KEYWORDSPseudomonasaeruginosa;Integron;Integratedgenecassette收稿日期： 20050706 修回日期： 20050917随着抗生素在临床抗感染治疗上的广泛使用，细菌耐药性问题日益严重，细菌间基因的水平转移是细菌多重耐药性形成和广泛传播的重要原因。整合子 (integron)系统具有捕获和表达外来耐药基因盒的能力，细菌可以通过该系统中的整合酶基因(intI)编码的整合酶 (integrase)不断地从周围环境中捕获和积累耐药基因盒，形成巨大的耐药基因多基因座。整合子可存在于质粒、转座子等可移动的基因元件上

7、，在同种或不同种属的细菌之间进行基因的水平转移1，2。整合子在多重耐药菌的形成及耐药基因的水平播散中起重要作用。研究表明，环境的抗生素选择压力对整合子及耐药基因在细菌中的分布起着重要作用，在革兰阴性细菌中发现的很多抗生素耐药基因都是作为基因盒的一部分而插入在整合子中的 3，4。目前根据整合子中整合酶基因(intI)的不同，将已经发现的整合子分为六类，其中第一类整合子最常见。本研究对石家庄、昆明两地临床分离的耐药性突出的院内感染条件致病菌铜绿假单胞菌进行第一类整合子的筛选及基因盒比较分析。1 材料和方法1.1 菌株临床分离铜绿假单胞菌 69 株，分别分离自石家庄 (PA1PA39)和昆明(PA4

8、0PA69)的医院；第一类整合子阳性对照菌株为V.choleraeO1strainSK10， 由 DepartmentofVeterinaryMicrobiology ， Denmark 的 AnitaForslund 博士惠赠；第一类整合子阴性对照菌株为E.coliC600，由日本大阪府立大学国际防疫学研究室山崎伸二教授惠赠。1.2 铜绿假单胞菌第一类整合子的检测1.2.1DNA 模板的制备将临床分离的铜绿假单胞菌、整合子阳性及阴性对照菌株分别接种于 LB 培养基中过夜培养； 取菌液 50l，悬浮在 450l 双蒸水中，在沸水中煮 10min 后，立即在冰中冷却。 稍后在 10000r/mi

9、n 条件下离心，上清液为粗提 DNA，-80保存。1.2.2 第 一 类整 合 子 整合 酶 基 因 (intI1) 扩 增设 计 引 物 intI1U(5 GTTCGGTCAAGGTTCTG3)和 intI1D(5GCCAACTTTCAGCACATG3)扩增 intI1 。PCR体系总体积为 50l，其中包括 10 PCR缓冲液 5l，模板 DNA2l，dNTP混合物 (each25mmol/L)4 ，l上、下游引物 (10pmol)各 15l，rTaqDNA聚合酶 025l(5U/ ，lTaKaRa生物工程公司 )，无菌双蒸水 3675l。PCR条件： 94变性 5min；9405min，

10、521min，72延伸 2min，30 个循环；最后 72延伸 7min。将 PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，凝胶经溴化乙啶染色，在凝胶成像系统 (BIORADGelDecEQ)下照像。1.3 第一类整合子相关基因盒扩增对以上筛选的第一类整合子阳性菌进 第 一 类 整 合 子 相 关 基 因 盒 扩 增 。 设 计 引 物inF(5 GGCATCCAAGCAGCAAGC3)和 inB(5AAGCAGACTTGACCTGAT3)扩增第一 类整合子相关基 因盒 。 PCR 反 应体系为 10缓 冲液 5l，dNTP(25mmol/Leach)4ul，inF 和 inB 各 3l，rTaqDNA聚合酶

11、 (5U/ l)025，l模板 DNA2l，加无菌双蒸水至 50l。PCR条件：94变性 5min；9430s， 52 1min，72延伸 2min，30 个循环；最后 72延伸 7min。将 PCR 产物在琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶经溴化乙啶染色， 在成像系统下照像。1.4 统计学分析采用2检验，分析两地铜绿假单胞菌第一类整合子阳性率及整合子相关基因盒的携带率有无差别。2 结果2.1 铜绿假单胞菌第一类整合子检测结果64 株铜绿假单胞菌临床菌株中共有 43 株菌扩增产生了923bp 的产物，即携带第一类整合子，阳性率为 672%，其中 25 株为分离自石家庄的临床菌株(阳性率为 714%)，18 株为分离自昆明的临床菌株(阳性率为 643%)(Tab.1和 Fig.1)。2.2 第一类整合子相关基因盒扩增在 25 株分离自石家庄的第一类整合子阳