高产乙酸乙酯酵母的菌种选育

1、高产乙酸乙酯酵母的菌种选育食品与发醇科技FoodandFermentationTechnology第46卷(第6期)Vo1.46,No.6高产乙酸乙酯酵母的菌种选育胡家俊,李锐利,陈茂彬,方尚玲(湖北工业大学生物工程学院,湖北武汉430068)摘要:从小曲中分离得到多株产乙酸乙酯酵母.通过初筛选出发酵性能优良的酵母菌,再通过耐温能力实验,耐酒精能力实验,耐酸能力实验,发酵后酯化力的测定,根据耐温,耐酒精,耐酸及产酯的综合能力进行复筛.最后选取出耐受性能好且产酯效率高的Yi4菌株,其4dN产酯量为0.465g/L.关键词:酵母菌;耐温;耐酒精;耐酸;产酯中图分类号:TQ926.1文献标识码:A文

2、章编号:1674506X(2010)0600810003ScreeningofEthylAcetateHighyieldYeastHUJia-jun,LIRui-li,CHENMaobin,FANGShang-ling(HubeiUniversityInstitute0厂BiologictEngineering,HubeiWuhan430068)Abstract:ManystrainsinethylacetateyeastwasisolatedfromXiaoQu.Throughtheearlyscreening,theexcellentpropertiesmicrozymewasscreen

3、edout.,Againthroughheatresistantabilityexperiment,alcoholresistanceabilityexperiment,acidabilityexperimentandesterificationforcemeasuringafterfermentation,accordingtoitscomprehensivevalueforheatresistance,alcoholresistance,acidresistantandproducingester,thestrainoftolerabilitywellandproducinghigheff

4、iciencyesterwasselected.ItwasY14anditsyieldofesterquantityis0.465g/Lfor4d.Keywords:microzyme,antiscar,resistancetoalcohol,acidresistant,produceesterdoi:10.39696.issn.1674506X.2010.06022酯类在白酒的香气形成中具有特别重要的作用,它是香气的组成成分,也是区别于其它蒸馏酒的主要特征之一,乙酸乙酯,乳酸乙酯,及已酸乙酯,丁酸乙酯四大酯类是酒中酯类主要组成成分.因而研究白酒的风味质量必然是把着重点放在酯类的含量上旧.首先

5、是乙酸乙酯,对于白酒中乙酸乙酯的形成一般认为是由于产酯酵母参与酒糟发酵的结果.国内自辽宁凌川试点开始,随后内蒙轻工所和西北五省白酒协作试点,先后对产酯酵母的工艺条件及生产应用进行了广泛的试验,都取得了较好的成绩.1材料与方法1.1材料1.1.1菌种来源酵母菌株:从实验室收集的大曲,小曲中分离得到.1.1.2培养基(1)液体YEPD培养基:葡萄糖2%,酵母膏1%,蛋白胨2%.(2)麦芽汁培养基(液态):麦芽汁,95%酒精(根据酒精度不同而异).(3)产酯培养基:葡萄糖2%,酵母膏0.5%,蛋白胨1%.(4)固体完全培养基:葡萄糖2%,酵母膏1%,蛋白胨2%,琼脂2%.收稿日期:20101108基

6、金项目:湖北省自然科学基金2008CDB0630;2o09年博士科研启动基金BSQD0910资助.作者简介:胡家俊(1982一),男,实验员,研究方向:细胞工程与分子生物学,湖北工业大学.素通讯作者:方尚玲,副教授E-maihfangs10095yahoo.corn .82食品与发酵,14-技2010年第6期(5)高渗再生完全培养基:固体完全培养基(YAPD)中加入0.6mol/L蔗糖.1.2方法1.2.1稀释分离法取适量大,小曲样品,分别加入到已灭菌的9mL麦芽汁培养基中,30cC培养24h增菌,再转入酒精体积分数为10%的培养基中,30培养24h,再转人酒精浓度为18%的培养基中,30cI

7、二培养72h,镜检,有无活菌存在,若有则取ImL接入YPD固体平皿中,30培养2d3d,待长出菌落后,选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离23次,经镜检为纯种后分别转入YPD固体斜面,低温保存.1.2.2初筛(产气性能测试)采用杜氏管发酵法,将分离纯化后的酵母菌接种于麦芽汁培养基中,置于28qC恒温培养箱中培养72h,测定酵母菌株产气泡的快慢及在规定时间内产气泡的多少l4】,初步比较各株酵母菌的起酵能力和发酵能力,初筛出发酵性能优良的酵母菌.1.2.3复筛1.2.3.1耐温能力实验:采用杜氏发酵管法,按2%接种量将活化后的酵母菌接人麦芽汁液体培养基中,分别置于28,30,32c【=

8、,37,40cc的恒温培养箱中,培养3dI一.观察杜氏管中的气泡产生情况(产气时间和产气量),比较各支菌株的耐温能力.1.2.3.2耐酒精能力实验:采用杜氏管发酵法,用95%酒精调麦芽汁酒精浓度为6%,8%,l0%,12%,14%,16%,见表1,按2%接种量将酵母菌接人酒精浓度为6%,8%,l0%,12%的麦芽汁培养基中,28cC恒温培养一周,观察杜氏管中的气泡产生情况(产气时间和产气量),比较各支菌株耐酒精能力.1.2-3.3耐酸能力实验:采用杜氏管发酵法,把麦芽汁培养基的pH用1tool几的H2sO4调制成1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,装入试管中,每管装量5mL

9、,灭菌后,按2%接种量接入活化好的酵母菌,28C培养4d.观察杜氏管中的气泡产生情况(产气时间和产气量),比较各支菌株耐酸能力.1.2.4发酵后酯化力的测定称取市售大米100g,粉碎机进行1min粉碎至细粉状,加入水500mL,包扎,l15oC,30rain条件下灭菌.将水浴温度调至60,以10%的HSO调整pH5.0,按每克米10uH人糖化酶,60保温3h,过滤得糖化液.用葡萄糖调糖度为12.Bx.将上述液体分装于300mL角瓶中,每瓶100mL,按10%接种量接种,3O发酵4d.发酵后的三角瓶每瓶180mL的95%酒精进行蒸馏,截取lOOmL初始蒸馏液,用NaOH滴定法(酚酞做指示剂,初始

10、NaOH量为25mL)及回流30min来测量其总酯含量,对比其酯化能力.总酸测定:采用NaOH直接滴定法;酒精度测定:用玻璃蒸馏器和酒精计测定;残还原糖测定:斐林试剂滴定法【刀;挥发酯测定:酸碱中和滴定法81.2结果与讨论2.1初筛与复筛结果表1杜氏小管产气情况Tab.1Gassing-productionofsources-dunaliellasalinatubular注:+表示略有产气现象,+表示产气量约等于杜氏小管体积的1/2,+表示产气量约等于杜氏小管体积.产气强烈的菌株为:Y2,Y6,Yl1,Y12,Y14.表2不同温度下酵母茵产气情况Tab.2Gassingproductionof

11、microzymeindifferenttemperature温度qC252830323740酵母,注:+表示杜氏小管中充满气体;+表示杜氏小管中充满2/3气体;一表示杜氏小管中无气体.表3不同酒精浓度麦芽汁培养基的配制Tab.3Confectmaltjuicemediumindifferentalcoholconcentration培养基含酒精/%6810121416麦芽-/mL9.279.068.858.648.438.2295%酒精/mL0.630.841.051.251.471.683结论由表1一表5中理化性能测试观察可知,初筛出的Y2,Y6,YI1,Y12,YI4五支菌株产气均为最强

12、,其中Y14在耐温,耐酒精,耐酸测试中表现突出,Y11,Y12十+.一+川m第46卷(蕙第160期)胡家俊等:高产乙酸乙酯酵母的菌种选育83表4酵母菌耐酒精能力Tab.4resistancetoalcoholabilityofmicrozymeY2Y6Y11Yl2Y14+J_一上一+注:+表示杜氏小管中充满气体;+表示杜氏小管中充满2/3气体;-I-表示杜氏小管中充满1/3气体;一表示杜氏,J,管中无气体.表5酵母菌耐酸能力Tab.5Anti-acidcapabilityofmicrozymeY2Y6YllY12Y14注:+表示杜氏小管中充满气体;+表示杜氏小管中充满2/3气体;+表示杜氏小管

13、中充满1/3气体;一表示杜氏小管中无气体.在耐酒精,耐酸试验中稍有逊色,Y6在耐温,耐酒精测试中与Y11,YI2差不多,但在耐酸测试中最为逊色,稳定性测试较其他四者差一些.由表6中产酯数值可知,最高产酯菌株为YI4,4d内产酯量为0.465g/L.表6酵母菌的产酯情况Tab.6Esterproducedofmicrozyme参考文献【1刘念,常少健,李国红等.已酸乙酯专用酯化曲酯化条件的优化研究fJ】.四川I食品与发酵.2008,44(5):5759【2】刘绪,许绿英,刘萍等酒自化酶产生菌的筛选与诱变选育J】.食品与发酵科技.2009,45(6):9一Il【3】杜连祥.工业微生物学实验技术【M

14、】.天津:天津科学技术出版社,1992:225.4】王梅.rIrC在产酯酵母选育中的应用【J1.酿酒,2001(5):6264.5】刘海臣,张敏楠,阮时雷,等.多样品耐高温产乙酸乙酯酵母的筛选及生长特性研究J.食品科技,2008(3):17-21.6】寇运同,胡永松,王忠彦,等.高温酵母发酵特性及功能的研究J】.酿酒科技,1995,(3):70-72.【7雷刚,胡志辉,陈禅友.蒽酮比色定糖法实验条件的改进探讨fJ1.长江蔬菜,200l,(8):3839.【8】卢忠,罗一帆中和滴定法测定牛磺酸含量J】.数理医药学杂志,2000,13(4):350行韭动态申报有机产品的条件和要求有机产品需要符合以下条件:原料来自有机农业生产体系加工,包装,运输,贮存,销售过程中不受污染;完善的质量控制和跟踪审查体系;生产过程中对生态破坏和环境污染最小;高水平的咨询师的专业指导;独立的认证机构认证.年内未使用过农药,化肥等禁用物质;种子或种苗未经基因工程技术改造过;生产基地