细胞复苏及冷冻.doc

1、细胞复苏及冷冻细胞培养基及冻存液的配制细胞培养基的配制 ,注意事项 , 为了避免不小心污染造成的浪费，一般用50ml 管分装配制。配置比例 ,45ml培养基 ,90%的总体积比例 ,+ 5ml FBS, 血清 ,10%的总体积比例 ,+ 500 L双抗 ,1:100 的比例 ,双抗 , 链霉素 +青霉素抑制细菌生长。细胞冻存液的配制 ,配置比例 ,5mlDMSO(100%纯度，以 10%总体积的比例 )+ 45ml 已配好的培养基 ,90%的总体积比例 ,注意事项 , 刚配好的细胞冻存液会发热，需用封口膜封住瓶盖后, 防止细菌污染 ,放入冰箱冷冻后再使用。过热的冻存液会使得细胞死亡,冻存液一般

2、提前一天配好即可，放置太久会DMSO二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide):是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，因其抗冻作用，可用于细胞的冻存 ;细胞冻存操作步骤 ,1、打开水浴锅，将培养基和冻存液用封口胶封好加热至37?。 2 、用酒精喷壶消毒 , 手及洁净工作台表面 , 进入工作台为防止污染均需酒精喷壶消毒,; 从培养箱中取出要冻存细胞的培养皿。3、用移液管吸出培养基，弃至废液缸 , 注意移液管勿碰到废液缸壁或其他物品 , 避免污染 , 移液管用完后倒插放置待用 , 。4、在培养皿中加入约10ml 的 PBS缓冲液冲洗，用移液管吸除,

3、移液管此时可以扔掉 , ，若有剩余的少量液体，用移液枪吸除。5、加入 1ml 的 TE，使得细胞消化 , 解除贴壁状态 , ，摇匀液体后放入培养箱中5min。6、镜下观察细胞是否消化, 即由扁平的伸展状态变回圆润的收缩状态, 此步骤不可省略 , 。7、在每个培养皿中均加入4ml 培养基，打匀后吸入50ml 离心管 , 因为培养皿多 ,15ml 离心管显然不够用 , 离心 5min,8000rpm, 。8、等待离心的同时，准备冻存盒。8.1 、若冻存盒是从冰箱中拿出，一定要升至室温之后再使用。, 水浴锅加热 ,8.2 、检查冻存盒中是否有异丙醇。, 异丙醇的作用是均匀缓慢降温, 9 、标记好冻存

4、管，细胞系名称、冻存人、冻存时间。10、取出离心后的离心管弃上清，尽量吸取干净，但不要把细胞吸入。加入冻存液，原则上每盘培养皿分3 管，每冻存管加1ml 冻存液。11、打匀后加入冻存管。12、记得检查冻存管盖子是否拧紧。13、先放入 ,80? 冰箱保存，接着放入液氮保存。大量细胞东村是，最好3 盘一次操作，防止最后分装冻存管时，demo对细胞的损害细胞复苏操作步骤 ,1、从液氮中取出细胞冻存管，放入37?水浴锅中迅速融化成液态。, 速融慢冻 ,2、将溶解的细胞倒入 15ml 离心管，加入 3ml 培养基，离心 5min。 3 、取 10cm培养皿一只，在其内加入 10ml 培养基，并做好标记。 4 、离心管弃上清。5、从培养皿中吸取1ml 培养基至离心管中打匀后，均匀加入培养皿。6 、行十字法晃动，使得细胞均匀散布，在镜下观察确认。7、放入培养箱，箱内再行一次十字法晃动。细胞复苏冻存的原则快速融化, 缓慢冷冻必