蛋白相互作用Pull.doc

1、蛋白相互作用Pull-Down头验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是 确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知 的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标 签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽 S-转移酶（GST 和多组氨酸（6X His ）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲2+2+和配体（如Ni和Co ） oPtiase 1In vitro Proy Protein Synlhosis(TNT

2、*T7SySln)PhasB 2Immobilization of Bair tG ST-fusion)Protein onto MagneGST Panidesproy prntGin detociedWashWashEluteJ|gst|-C + QFigure 1 Overview of the MjgneGST Pnll-Dtnvii System protocoL P h Prey Protein, M = MAgneGST PjtftKk.实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶) 、离心机、 实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂： Binding

3、Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaC、l 10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、 2%SD、S 0.1%溴酚蓝、 10%甘油、 10mM DTT裂解缓冲液： 20mMTris-Cl(pH8.0) 、 200mM NaCl、 1mM EDTA(pH8.0)、 0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。 ( 蛋白酶抑制剂： 2ug/ul 抑肽 酶( aprotinin )、1ug/ul 白胃素( leupeptin )、 0.7ug/ml 胃

4、酶抑素( pepstatin )、 25ug/ml 苯甲磺酰氟( PMSF)实验方法： 方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%?胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在 4C混合 孵育 2h。离心机12,000g在4C离心2min。 将上清转移至新的离心管中。2、探测细胞裂解液 两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul ?胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。 在 一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。两 个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在4C翻转混合孵育 2h。最大速度在4C离心样品2min。 在新的微量离心管中收集上

5、清。 用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。重复洗三次。加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱 GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心2min。将洗脱蛋白质与等体积的2X SDS-PAG上样buffer混合。3、检测相互作用蛋白质将样品煮沸4min,进行SDS-PAG凝胶电泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在4 C孵育结合30min。2、 结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结 合在4 C作用4h。3、3000rpm在4C离心5min

6、,除去上清。4、 用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4C离心5min, 除去上清,重复 5 次。5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行 SDS-PAG电泳分析。方法三：实验试剂： PBS(140mM NaC、l 2.7mM KCl、 10mM N2aHPO4、 1.8mM KH2PO4) Elutio n Buffer: 50mM Tris-CI(pH8.0)、10mM还原型谷胱甘肽0.154g 溶解到 50ml 50mMTris-Cl(pH8.0) 中配制 Elution Buffer 。1 、细胞裂解取 1ml 细菌培养液离心去上清, 加 200ul 细胞裂解液到菌丸, 在

7、室温下重 悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育 20-30min。2、固定GST融合蛋白到柱子上将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取 20ul 到 1.5ml 离心管中,小心去除上清,加 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer 到凝胶中,混匀。重复洗 3 次以上。平衡好的凝胶用 100ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。加 200ul 含GST融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min。小心移去上清，(保存以便分析，)将 250ul Binding Buffer 或 washBuffer 加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵

8、育5min。小心移去上清。加入 250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗，将凝胶用 20ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。3、捕获猎物蛋白将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入20ul含猎物蛋白的溶液，将155ulBinding Buffer 或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝胶中，在室温下旋转 孵育1h。移去上清。将 400ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加入凝胶中，轻柔混匀，在室温 下孵育5min，移去上清。加 400ul Binding Buffer 或was

9、h Buffer再次清 洗凝胶。小心移去上清。分析：加20ul SDS-PAGEoading Buffer，在室温下混合 5min。取出上清用 于分析。His Pull-Down 方法 实验试剂：Binding Buffer: 20mM Tris-CI(pH8.0)、150mM NaCI 20mM咪唑Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl 500mM咪唑实验步骤：1、结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤，2、 与Ni-NTA树脂(1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂)4C混合孵育3h3、待树脂沉淀后用 10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白

10、。4、用 6 倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。6、SDS-PAG电泳分析7、纯化的蛋白与Ni-NTA树脂冰浴作用2h，8、10 倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，9、然后加入过量 100ug/ml 蛋白溶液，冰浴作用 2h，10、用 10 倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，11、加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，12、 洗脱蛋白进行SDS-PAGE口 Western-blot分析鉴定。13、阴性对照为结合蛋白溶液加入 Ni-NTA 树脂中冰浴作用 2h。 1 0倍柱体积 的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，注意事项：1、所有过柱的液体都要经过0.45um或0.22um的滤膜。2、平衡柱子：2.1 用 3-5 个柱体积蒸馏水洗柱2.2 用 3-5 个柱体积的 binding buffer 平衡柱子。3、洗柱：如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质3.1除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积 的 PBS洗柱3.2 除去疏水性物质， 用 3-4 个柱体积的 70%乙醇或 2 个柱体积的含 1%TritonX-10