夏枯草对草酸结石小鼠钙代谢及肾脏组织结构的影响9.1资料.doc

1、夏枯草对草酸结石小鼠钙代谢及肾脏组织结构的影响李静胡国全桂敬强贺绍君刘德义陈会良靳二辉（安徽科技学院动物科学学院安徽省凤阳县东华路9 号 233100）摘要： 目的探讨夏枯草对草酸结石小鼠的钙代谢及肾脏组织结构的影响。方法用乙二醇和氯化铵诱导结石，用夏枯草干预，第28d，测定血清中钙和磷含量，测定肝脏、右侧肾脏和脑组织匀浆中的钙含量，左肾用于制作HE 染色切片。 结果结石组肾钙显著高于对照组（ P0.05），而夏枯草组肾钙显著低于结石组（P0.05），与对照组差异不显著。各组的血清、 肝、脑组织匀浆中钙含量差异均不显著。结石组的肾小管腔中分布大量散在的透明草酸钙晶体，夏枯草组肾组织未见草酸钙晶

2、体沉积，且肾小管扩张情况明显缓解。结论 夏枯草可减少草酸结石小鼠的肾钙含量，减缓肾小管的扩张，保护肾小管上皮细胞组织结构，可做为防治草酸结石的辅助药物。关键词：夏枯草；草酸结石；肾；小鼠中图分类号：S853.7文献标志码： A文章编号：Effect of Prunella vulgaris L. on Calcium Metabolism and Renal Structure of Calcium Oxalate Stones in MiceLI Jing* , Hu Guo-quan, Gui Jing-qiang, He Shao-jun, Liu De-yi, Chen Hui-lia

3、ng Jin Er-hui(College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100,China)Abstract: Objective To investigate the intervention effect of Prunella vulgaris L. on calcium oxalate stones in mice of calcium metabolism and renal structure. Method The mice with calcium

4、oxalate stone formation were induced by 1% ethylene glycol and 1% ammonium chloride, meanwhile used Prunella vulgaris L. as intervening factors. After 28 days, the calcium and phosphorus content was measured in serum. The content of calcium in liver ， right kidney andbrain organization homogenate we

5、re detected Histological section of left kidney were made HE staining. The calcium content and phosphate content in kidney tissues a was determined. Histological section of kidney were made HE staining. Results That calcium levels in renal tissue收稿日期：基金项目：安徽科技学院自然科学研究项目（ ZRC2013366 ）；安徽科技学院重点学科基金项目

6、(AKXK20101-2)作者简介：李静（1979），女，黑龙江省齐齐哈尔人，讲师，博士。从事中草药防治结石疾病方面的研究，Tel， E-mail ： lijing3719 。李静为通讯作者。11 ，主要含有三萜及其苷类、甾of Oxalate Calcium Stone group was significantly higher than normal control group（ P0.05） ,calciumlevels inrenaltissue ofPrunellavulgarisL.Oxalate CalciumStone group wassigni

7、ficantly lower than Oxalate Calcium Stone group （ P 0.05） , and than normal control group was no significant differences. The content of calcium in liver and brain organization homogenate in each groups was no significant differences. The calcium oxalate stones in renal tubular were visible in the O

8、xalate Calcium Stone group, crystals deposition of calcium oxalate stones in Prunella vulgaris L. group were significantly reduced, significantly reduce renal tubular dilation. Conclusion The Prunella vulgaris L. could reduce the calcium content in renal organization homogenate, urea nitrogen and cr

9、eatinine content in the body, and slow the expansion of renal tubular, protection of renal tubular epithelial cell structure in mice of calcium oxalate stones, canbe used as supplementary drug in preventing oxalate calcium. Keywords: Prunella vulgaris L. ; calcium oxalate stones; kidney; mice夏枯草（ Pr

10、unella vulgaris L. ）属于唇形科夏枯草属植物，命名取其“夏至后即枯”之意，药用部位为干燥果穗，全草也可入药醇及其苷类、黄酮类、香豆素、苯丙素、有机酸、挥发油及糖类等成分2 。夏枯草在调节血压和血糖，消炎杀菌，抗病毒感染，抑制肿瘤生长方面广泛应用 3 。 Utsunomiya4 等首次发现在体外模拟试验中夏枯草水提取液能有效抑制草酸钙结晶的形成。夏枯草水提取液和甲醇提取物在体外对草酸钙结晶形成均有抑制作用 5 ，推测其原因可能夏枯草促进草酸钙结晶的成核作用，但因其促进成核和微结晶作用，故而降低了草酸盐的饱和度， 从而显著抑制草酸钙晶体的聚集和生长6-7 。草酸钙结石属中医“石淋

11、” 、“砂淋”范畴 8 ，病因是肾虚湿热蕴结于下焦、久之烧灼尿液中杂质结成砂石 9 ，夏枯草苦寒，能除湿泻热，疏肝解郁，同时夏枯草利尿作用明显，提示夏枯草可能成为防治结石的辅助药物10 。本试验采用1%乙二醇和 1%氯化铵溶液饮水诱导形成草酸钙结石模型， 测定小鼠血清、肝脏、肾脏、脑组织中钙、磷的含量，探究夏枯草对草酸结石小鼠的钙、 磷代谢的影响，研究夏枯草对草酸结石小鼠肾小球和肾小管组织结构的保护作用， 为进一步研究其药用价值和开发防治草酸结石的药物提供试验依据。1 材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物由安徽省试验动物中心提供的SPF 级昆明小鼠 30 只，雄性， 60 日龄，动物生产

12、许可证号SCXK( 皖 )2011-002。试验鼠颗粒饲料中钙含量1.43，磷含量0.87 。小鼠饲养环境温度20 24 ，湿度 50 %65 %，光照 12 h13 h。21.1.2试验药品与试剂氯化铵（NH 4Cl），沪试生产，批号：F20050621，分析纯。乙二醇（C2H6O2），国药集团化学试剂有限公司生产，批号： T20110608，分析纯。夏枯草，经安徽科技学院食品药品学院时维静教授鉴定为正品，安徽省福春堂中药饮片有限公司，产地：湖南，批号：2011063；圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的生化分析试剂盒： 钙试剂盒，批号：142211014；无机磷试剂盒， 批号： 14241

13、1013。南京建成生物工程研究所生产试剂盒：钙测定试剂盒，批号：20120413；磷测定试剂盒，批号： 20120418，用于测定组织蛋白的考马斯亮蓝试剂盒， 20120415，乙醇、二甲苯、伊红、苏木精等均为国产级分析纯。1.1.3试验主要仪器设备自动煎药包装机，青岛达尔电子机械销售有限公司；Mindray BS 200 全自动血清生化分析仪；分光光度计；离心机；高压蒸汽灭菌器；电动玻璃匀浆机；漩涡混合仪； IEICA-RM-2128 型切片机， LY-1 型展片机； OLYMPUS-CH30 显微摄影系统。1.2试验方法1.2.1草酸钙成石液的配制参考文献 11 中的建立草酸结石模型小鼠方

14、法配制草酸钙成石液：配制比例为：氯化铵 1 g，乙二醇 1 mL，用蒸馏水定容到100 mL。1.2.2 夏枯草水煎液的制备将 500g 的夏枯草放入无纺布煎药袋中，浸泡入5 L 水中 2h，自动煎药包装机煎煮至沸腾后文火30min，过滤；药渣再次加入2.5L 水，煎煮至沸腾后文火20min，将两次滤液混合，浓缩至250mL，相当于2g/mL，高压蒸汽灭菌， 4冰箱存放。1.2.3 分组与采样小鼠适应性饲养 1w 后，按体重相近原则分为对照组，结石组和夏枯草组。结石组和夏枯草组饮用草酸钙成石液， 对照组饮用蒸馏水。 小鼠给药采用灌胃方式，夏枯草组灌胃夏枯草水提取液 10mL kgd，对照组和结

15、石组灌胃相应体积的生理盐水，持续 28d。试验结束时，小鼠禁食不禁水过夜，称重，双侧眼球摘除法采血，制备血清，血清中的钙、磷含量用 Mindray BS200 全自动血清生化分析仪测定，处死剖杀，取肝脏，肾脏，脑组织，按公式计算肾体比，肾体比3（ %）=肾脏湿重（ g）/宰前活重（ g）100，其中左侧肾脏采用 4中性甲醛固定，石蜡包埋， 6m 切片， HE 染色，观察组织结构，右侧肾脏用于测定组织匀浆中的钙、磷含量。肝脏，右侧肾脏，脑组织用冰生理盐水冲洗后制备 10%的组织匀浆，用南京建成生物工程研究所生产试剂盒测定钙含量。1.3数据统计分析所有试验数据均采用均数 标准差（ MSD）表示，用

16、 spss17.0统计软件进行数据分析各数据之间的统计学差异， P 0.05 为有统计学意义。2 试验结果2.1夏枯草对草酸钙结石小鼠体重和肾体比的影响表 1 各组小鼠肾脏指数的比较Table 1 The comparison of the mice s kidney index in each group组别宰前体重 (g)肾体比（ %）Groupweightkidney index对照组27.78 1.731.12 0.09normal control group结石组30.17 4.361.64 0.16*Oxalate Calcium Stone group夏枯草组29.81 2.16

17、1.11 0.14Prunella vulgaris L. group注：与对照组比较* 表示 P0.05，* 表示 P0.01；与结石组比较 表示 P0.05， 表示 P0.01，下同。Note: that compared with the normal control group, *P0.05, * P0.05, that compared with the Oxalate CalciumStone group, P0.05, P0.05, the same below.由表 1 数据可显示，各组小鼠的宰前体重差异均不显著，结石组的肾体比极显著高于对照组，均数高0.52%，结石组的肾体

18、比极显著高于夏枯草组，均数高0.51%，而对照组和夏枯草组的肾体比差异不显著。2.2 夏枯草对草酸结石小鼠血清钙、磷及肝、肾，脑组织钙含量的影响表 2 各组小鼠血清钙、磷及肝、肾，脑组织钙含量的比较Table 2 The comparison of the mice s calcium and phosphorus levels in serum and calciumin liver ， kidney and brain organization in each group组别血清Ca血清 P肝组织肾组织脑组织4Group（ mmol/L ）（mmol/L ）Ca(umol/gprot)Ca

19、(umol/gprot)Ca(umol/gprot)calciumphosphoruscalciumincalciumincalciuminrenal tissuekidneybrain对照组2.04 0.112.520.2594.48 2.8092.63 2.3346.06 3.96normal control group结石组2.01 0.303.430.48*96.78 5.28103.38 3.38*47.48 1.38Oxalate Calcium Stonegroup夏枯草组1.95 0.172.770.6196.82 3.6390.30 1.5446.72 4.75Prunell

20、a vulgaris L.group由表 2 数据显示，各组小鼠血清钙含量差异均不显著， 结石组小鼠血清磷含量显著高于对照组和夏枯草组（ P 0.05），对照组和夏枯草组的血清磷含量差异不显著，结石组小鼠肾组织中钙含量显著高于对照组和夏枯草组 (P0.05)，对照组和夏枯草组的肾组织中钙含量差异不显著， 各组肝组织、脑组织中的钙含量各组差异均不显著。2.3 夏枯草对尿酸结石小鼠肾组织结构的影响RcRcDtPt图1 对照组肾脏皮质（HE，400）图 2 对照组肾脏髓质（HE， 400）Fig. 1 Kidney cortex in normal control groupFig. 2 Kidne

21、y medulla in normal control groupRcDtPt5图 3 结石组肾脏皮质（HE ，400）图 4结石组肾脏髓质（HE，400）Fig. 3 Kidney cortex in Oxalate Calcium Stone groupFig. 4 Kidney medulla in Oxalate Calcium Stone groupRcDtRcPtRc图 5 夏枯草组肾脏皮质（HE ，400）图 6 夏枯草组肾脏髓质（HE，400）Fig. 5 Kidney cortex in Prunella vulgaris L. intervention groupFig.

22、6 Kidney medulla in Prunella vulgaris L. intervention group注： Rc肾小球；Pt 近曲小管； Dt 远曲小管Note: Rc Renal corpuscle; Pt Proximal convoluted tubule; Dt Distal convoluted tubule;草酸钙结晶在常规 HE 病理切片下为无色透明晶体，由图 1 可见正常组小鼠肾小体断面接近圆形， 毛细血管球位于肾小体中央且结构完好， 肾小囊壁层和脏层细胞结构清晰，肾小囊的结构和体积大小正常，肾小管排列紧密，近端、远端肾小管组织结构清晰且管腔大小正常， 近曲小管

23、管径较粗， 管腔较小， 远曲小管管径较细，管腔较大，腔面规则，细胞排列紧密，对照组大鼠未见肾小管扩张和草酸钙晶体沉积， 无病理变化，图 2 可见肾脏髓质内远端肾小管和集合管管壁上皮细胞排列整齐， 管腔大小正常， 细胞界限明显。 图 3 中结石组小鼠肾小球体积和囊腔大小正常， 皮质部肾组织肿胀， 近端肾小管的管壁肿胀变厚， 管腔大小未见明显变化， 远端肾小管管壁轻微变薄且管腔扩张， 明显变大， 图 4 中结石组部分髓质内远端肾小管和集合管管壁变薄且模糊，细胞数量减少，界线不清晰，细胞结构紊乱，上皮细胞坏死、脱落、变性，细胞核大部分降解，胞浆减少，排列不整齐，肾小管腔显著变大粗， 异常扩张，管壁细

24、胞结构不完整， 变性、坏死，肾小管腔内有的大量弥漫散布的透明结晶体， 部分结晶体形成较大的不规则四边形或六边形或连成片状， 部分肾小管的管腔内可见嗜伊红样染色坏死物质及部分 , 肾间质有明显慢性炎性细胞浸润， 图 5 可见夏枯草组肾小球的轻度萎缩， 肾小囊腔变大，肾小囊壁层和脏层细胞结构模糊， 近端肾小管的管壁肿胀轻度肿胀且管腔缩小，远端肾小管管壁变薄且管腔变大， 图 6 显示夏枯草组肾髓质内远端肾小管和集合小管未见异常扩张，但部分肾小管管壁变薄，上皮细胞界限较为清晰，6部分肾小管管腔中有红色丝状物质渗出，未见结晶体，髓袢细胞结构正常。3 讨论乙二醇是草酸的前体物质， 在机体内可转化为草酸，

25、从肾脏分泌排泄， 氯化铵可酸化尿液，具有肾毒作用，可损害肾小管，二者协同，可形成泌尿系统的草酸钙结晶 12。采用乙二醇配合不同药物或试剂作诱石剂诱发大鼠肾草酸钙结石模型，可以筛选、评价防治结石药物疗效 13 。本试验中结石组的肾体比极显著高于对照组和夏枯草组， 可能草酸结石小鼠在氯化铵和乙二醇的刺激作用下， 肾脏中草酸钙结晶沉积及继发的机械性、 阻塞性炎症使肾脏肿胀增重。 夏枯草组与对照组肾体比接近， 说明夏枯草可能在减少肾脏中草酸钙结晶及缓解肾脏炎症方面发挥一定的作用。机体内钙的代谢异常是引起含钙尿路结石的重要因素之一。 泌尿系结石产生是由于体内促进结石和抑制结石的条件失衡所致，其成分以草酸

26、钙结晶居多14-15 ，其形成与体内钙代谢和沉积及草酸代谢有关。 草酸钙结石的形成与高钙尿有关，肾脏远曲小管和集合管的上皮细胞受损导致钙的重吸收障碍， 也可导致肾小管上皮细胞的粘附性增加 16 。肖劲逐 17 等研究表明，饮用 1%乙二醇 + 3%NH4Cl 3.0 mL 每天分两次灌胃 Wistar 健康雄性大鼠，连续 4 w 给予一定剂量的夏枯草不同提取物干预， 结果显示各组钙磷无差异， 夏枯草水溶和夏枯草 50% 甲醇组肾钙明显低于草酸钙结石模型大鼠结石组。 本研究的结果表明各组血清钙差异不显著。结石组的肾组织钙浓度明显高于正常组和夏枯草组， 差异有显著性意义，可能由于肾组织中形成大量草

27、酸结晶有关。 在夏枯草干预下， 能够明显降低造模后雄性小鼠血钙和肾组织钙的浓度， 结石组血磷升高， 可能是机体为了保证血钙和血磷代谢的平衡， 反馈地增强了肠道对磷吸收的结果。 各组肝组织、 脑组织的钙含量差异均不显著， 说明尿道结石主要影响肾钙的含量， 而不影响其他脏器组织中钙的含量影响。 钙磷代谢受动物品系、 试验条件等多种因素影响， 夏枯草与钙代谢的关系需要进一步的验证和研究。乙二醇和氯化铵是制备草酸钙结石模型常用药物， 1%氯化铵和 1%乙二醇溶液给予小鼠自由饮用，可诱导形成草酸结石，本试验第 28d，结石组的肾小管中可见大量的草酸结晶，肾小管扩张，与文献报导一致 18。肾组织内的晶体沉

28、积受到肝脏将乙二醇等草酸前体转变为草酸的速度以及尿钙和草酸的排泄等因素影响。从本试验可见夏枯草减少草酸结石小鼠肾组织中的结晶， 并有效缓解肾小管和集合管的扩张， 减少肾小管上皮细胞的损伤， 提示夏枯草可能存在抑制尿草酸钙结晶形成物质，通过减少结晶保护肾脏，减少对肾小管的组织结构的损伤。肾脏受损与草酸钙晶体沉积相关， 夏枯草可能通过吸附于草酸钙晶体表面的能力增强，抑制草酸钙结晶聚集和生长， 以减缓肾小管细胞损伤。 体外模拟环境与体7内环境存在温度、 pH 值等多种因素差异，体外试验证明，0.25mL 夏枯草水提液对 10mL 人工尿液中的一水草酸钙结晶的抑制指数随 NaCl 浓度和 pH 值升高

29、逐渐降低 19 。体外试验和体内试验，抗草酸结石作用机理和途径可能不同，虽然体外试验中夏枯草可显著抑制草酸结晶的形成， 提示夏枯草中可能存在抑制尿草酸钙结晶形成物质，但其抗草酸结石的作用机制有待于进一步探讨。4 结论夏枯草水煎煮液能够降低草酸结石小鼠肾组织中的钙含量，但对血清、肝、脑组织匀浆中钙含量均无显著差异，夏枯草能够减少肾小管内草酸钙结晶的大小和数量，减缓草酸结石小鼠肾小管的扩张程度，可保护肾脏的组织结构， 在防治草酸钙结石中发挥一定的作用。参考文献1刘悦 ,宋少江 , 徐绥绪 .夏枯草的化学成分及生物活性研究进展J. 沈阳药科大学学报 ,2003,20(1):551.2崔体圣 ,苗明三

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31、提取物对尿草酸钙结石形成的抑制作用 J. 中华试验外科杂志 ,2007,24(12):1605.6 Mayur Danny I Gohel, Siu Ping Wong. Chinese herbal medieines and their efficacy in treating renal stonesJ.UrolRes,2006,34:365-372.7Koide T, Yamaguehi S, Utsunomiya M, et al. The inhibitory effect of kampou extracts on in vitro calcium oxalate crystal

32、lization and in vivo stone formation in An animal modelJ. Int J Urol, 1995,2(2):81-86.8 刘海华,张亚强.泌尿系结石中西医结合研究概述与展望J. 北京中医药, 2013,32(7):553-555.9 刘玲珠 .中医治疗泌尿结石近况 J.右江民族医学院学报 ,1997,(1):152-153.10 肖劲逐 . 夏枯草提取物对尿草酸钙结石形成及肾结石大鼠osteopontin 表达的影响 D .长沙：中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，2008， 1.11 蒋一强，李山， 吴闯， 等玉米须及芭蕉芯对小鼠肾草酸钙结晶抑制作用的形态定量研究 J. 成都中医药大学学报，