IEc介导志贺菌的头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究可编辑

1、ISEcp1 介导志贺菌头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究ISEcp1 介导志贺菌头孢菌素抗生素耐药的 分子机制研究 #1,211,31*510152025303540（1. 郑州大学公共卫生学院 , 郑州 450001;2. 河南科技大学医学院 , 洛阳 471003;3. 新乡医学院公共卫生系 , 新乡 453003）摘要:目的 研究头孢噻吩诱导前后志贺菌 ISEcp1 与 blaCTX-M 基因的位 置关系及其在志贺菌CTX-M超广谱B -内酰胺酶表达中所起的作用。方法用头抱噻吩的次抑菌浓度对临床分离鉴定的志贺菌进行诱导耐药试验。对志贺菌出发株及诱导耐药株的ISEcp1、 blaCTX-M

2、 进行聚合酶链反应PCR采用PCR-mapping及DNA测序分析比较其诱导耐药 前后 ISEcp1 与blaCTX-M 的位置关系差异。将 PMD19-T 空载体、该志贺菌 CTX-M 基因全 长, 及前述PCR-mapping 获得 的 包含 ISEcp1 下 游及 CTX-M 基因 全长 的片 段即 ISECTX 片段 ）分别与 T载体连接转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中得到DH5a T、DH5a CTX和DH5x ISECTXRT-PCR观察DH5a CTX和DH5a ISECTX的blaCTX-M 基因表达水平差异。 药敏试验观察各克隆株的耐药性差异。 结果 成功获得志贺菌诱导耐药

3、株 , 该诱导耐药株对 头孢噻吩高水平耐药。志贺菌敏感株和诱导耐药株 PCR 扩增均扩出 ISEcp1 和 blaCTX-M 且为 CTX-M-1 亚组blaCTX-M-55,但只有诱导耐药株blaCTX-M基因上游存在ISEcpI插入序 列。测序发现此插入序列为 blaCTX-M 基因提供启动子 -35 及-10 位点及 1 个右反向重复序 列（ 转位酶识别位点）。DH5x ISECTX较DH5a CTX的CTX-M超广谱B -内酰胺酶表达水平高， 且该克隆株对头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢吡肟的耐药性较强。 结论 在外 界头孢噻吩抗生素压力下 , 敏感志贺菌中 ISEcp1 可转座到

4、 blaCTX-M 基因上游并使下游blaCTX-M 基因高水平表达 , 导致对头孢菌素耐药关键词：流行病学；志贺菌；耐药;ISEcp1;blaCTX-M中图分类号 :R378.2Study on the molecular mechanism of ISEcp1 involved in cephalosporin resistance in ShigellaWang Yingfang1,4, Yang Haiyan2, Duan Guangcai1,5, Xi Yuanlin31. College of Public Health , Zhengzhou University , Zheng

5、zhou, 450001;2. Colledge of Medicine, HenanUniversity of Science and Technology, Luoyang, 471003;3. College of Public Health , Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003;Abstract： Objective To compare the location of ISEcp1 in Shigella flexneri before and after inducedby CephalothinCF, and study t

6、he relationship between the CTX-M extended spectrum beta-lactamaseexpression. Methods Clinical shigella flexneri strain was induced into anti-drug strain by 1/2 MICinduced trails of CF. ISEcp1 and CTX-M were amplified by polymerase chain reactionPCR inoriginal strain and induced anti-drug strainPCR-

7、mapping was used to detect blaCTX-M, ISEcp1 andanalyze their relatioship. The PCR products were sequenced and compared. The complete blaCTX-Mand the ISECTXincluded downstream of ISEcp1 and the complete blaCTX-M were inserted in aT-vector and transformed into DH-5a which were named DH5 a CTX andDH5x

8、ISECTX. Theexpressing levels of blaCTX-M in DH5a CTX and DH5a ISECTX were detected by RT-PCR.Sususceptibility tests were performed in the two clones. ResultsInduced anti-drug strain of shigellaflexneri was obtained successfully. It is resistant to cefalotinCFat a high level. ISEcp1 andblaCTX-M-55 we

9、re found in original strain and induced anti-drug strainblaCTX-M-55 was flank基金项目: 高等学校博士学科点专项科研基金博导类 （编号:207）作者简介:王颖芳 1977.3-, 女,讲师,博士研究生,分子流行病学 通信联系人 :段广才 1958.8-, 男,教授,分子流行病. E-mail: gcduan/0.-145505560upsream by an ISEcp1 element provide a right inverted repeat IRRrecognized by transposase; -35a

10、nd -10 promoter sequences may drive the expression of blaCTX-M gene at a high level. Theexpressing levels of blaCTX-Min DH5a ISECTXwas higher than DH5a CTX.The antibioticresistances of DH5a ISECTX to ceftotaximeCTX, ceftriazoneCRO,cefurosimic sodiumCXMand cefepimeFEP were higher than DH5x CTX. Concl

11、usion ISEcpI element could translocateupstream of blaCTX-M in S. flexneri following induction by cephalothin. ISEcp1 may drive theexpression of the balCTX-M geng at a high level in Shigella spp.Key words: Epidemiology;Shigella flexneri; drug resistance; ISEcp1; blaCTX-M0 引言由于具有广谱抗菌活性的头抱菌素大量使用，造成了产超广

12、谱B -内酰胺酶 (extendedspectrum beta-lactamase,ESBLs)细菌在世界范围内的流行。 CTX-M型属于 非 TEM 和 SHV型 ESBLs, 此类酶可水解头抱菌素 , 其抗菌活性可被克拉维酸所抑制 1 。CTX-M-ESBLs按照氨基酸相似性划分为 6 个亚组, 即 CTX-M-1、CTX -M-2、CTX -M-8、CTX -M-9、CTX -M-25和 CTX -M-45 组, 迄今发现 140 余种。近年来通过对 CTX-M-ESBLs 周围的 “基因环境”进行研究 , 发现位于 blaCTX-M-like 上游的的插入序列 ISEcp1 可能对其表

13、达和水平传播起重要作用2,3。目前志贺菌中ISEcp1在产CTX-M超广谱B -内酰胺酶志贺菌耐 药中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨志贺菌中插入序列ISEcp1与CTX-M型超广谱B -内酰胺 酶与的关系 , 及其在产CTX-M超广谱B -内酰胺酶志贺菌耐药中的作用。1 材料与方法651.11.1.1材料菌株1.1.1.1大肠埃希菌ATCC-25922(药敏实验标准控制菌)购自河南省临床检 验中心。1.1.1.2 志贺菌出发菌株 mel-sf1998023/zz: 采用改良 K-B 纸片法筛选一 株对头孢噻吩(Cephalothin ,CF) 、 诺 氟 沙 星 (Norfloxacin,NO

14、R) 、 庆 大 霉 素 (Gentamycin,GM) 、70磺胺甲基异恶唑 (Cotrimoxazole,SMZ) 均敏感的福氏志贺菌。临床分离鉴定 的野生志贺菌出发菌株 mel-sf1998023/zz 来源于郑州大学第三附属医院。1.1.2试剂SS琼脂、EMB琼脂、营养琼脂、水解酪蛋白(Mueller-Hinten,MH)琼脂产自 上海市医学化验所。各种琼脂平板在本实验室按配方配制。头孢噻吩为标准品 , 购 自中国药品检验75中心。PCR相关试剂购自北京天根生化科技有限公司。药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有PMDI9-T 载体TRIzol限公司。感受态细胞DHa购自郑州创生生物工程有限

15、公司。 购自TaKaRa公司。DNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司 购自 Invitrogen 公司。1.1.3引物80 由北京赛百盛基因技术有限公司合成。-21.1.3.1 插 入 序 列 ISEcp1 引 物3: P15-GCAGGTCTTTTTCTGCTCC-3 , P2 5-TTTCCGCAGCACCGTTTGC-3扩增片段长度为527bp,退火温度为58 C。1.1.3.2 blaCTX-M 引 物4: P35-CTTCCAGAATAAGGAATCCCAT-3JP45-CCCATTCCGTTTCCGCTA扩增完整的 blaCTX-M基因,扩增片段长度为914bp

16、,退85火温度为56 C。1.1.3.3若blaCTX-M上游存在插入序列ISEcpI则用PCR-mapping应扩增出1372bp 片段 , 此片段命名为ISECTX,引物为:P5温度为57 E 。5-TTGGGCGAATGAAGCCGTGT-3, P同前），退火1.1.3.4CTX-M-1 亚 组 blaCTX-M 基 因 引 物 5: P65-CGCTTTGCGATGTGCAG-3 , P7905-ACCGCGATATCG TTGGT扩；增 CTX-M-1 亚组 blaCTX-M基因,扩增片段长 度为 551bp,退火温度为52 C。1.1.3.516SrRNA 基 因 引 物6: P8

17、5-TGATCCTGGCTCAGATTGA-3 , P95-TTTACGGCGTGGACTACC扩增片段长度为803bp,退火温度为56C。1.2方法951.2.1菌株鉴定对临床分离株进行生化、血清学及抗生素敏感性鉴定。1.2.2次抑菌浓度诱导耐药志贺菌试验 将志贺菌的标准株和敏感株接种到固体培养基中 , 用肉汤稀释法测定最低抑 菌浓度MIG然后将出发菌株在含1/2MIC的CF的营养肉汤液体培养基中传代，20 代后转无药物100LB固体培养基,挑单个菌落测 MIC,当药物诱导后 MIC 4倍诱导前MIC 时结束诱导 ; 并设在不含药物的液体培养基中培养 20 代作对照。经此实验将获得一株志贺

18、菌诱导耐药株命名为 YDC。1.2.3志贺菌插入序列 ISEcp1 、blaCTX-M 基因及 ISECTX 片段的检测DNA提取试剂盒提取模板 DNA。PCR扩增体系为50卩l:PCR mixture 25卩 l， 引物各1051卩I10M,模板DNA 2卩l,ddH20 21卩l;反应条件为:94 C预变性5 min,循环参数为:94 C 60s,退火温度如前面材料中所述 45s,72 C 60s共32个循环，最后72 C延伸10min。取 5 卩 l PCR产物进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳 , 用凝胶成像仪观察结果并照相1.2.4克隆构建1.241 T 载体克隆DH5a T的构建：取pM

19、DI9-Tvector l卩l加人DH5a 感受态细胞中 , 冰水中110放置30 min,42 C加热90 s 后，再在冰水中放置 2 min,加入1000卩ILB 培养基,37 C振荡培养60 min。取150卩l培养菌液均匀涂布在含有 Amp的LB平板培养基 上,37 C培养过夜。挑选单菌落 , 在 LB 液体培养基中增菌培养。1.2.4.2 完整blaCTX-M 基因克隆DH5a CTX及ISECTX片段克隆 DH5aISECTX的构建：禾I-3-用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收 blaCTX-M 基因或 ISECTX 片段的 PCR 产物。按照 pMDl9-T115120vect

20、or试剂盒说明，在微量离心管中配置如下连接反应体系，全量为10卩l:Solutionl 5 卩 l,lnsertDNAblaCTX-M基因或 ISECTX 片段的 PCR 产物 4 卩 l,pMDl9-T vector 1 卩l 。置于 16 C , 反应过夜。全部加入100卩l DH5 a感受态细胞中，冰水中放置30 min,42 C加 热 90 s 后, 再在冰水中放置2 min,加入890卩l LB 培养基,37 C振荡培养 60 min。取150卩l培养菌液均匀涂布在含有x-gal、IPTG Amp的LB平板培养基上，37 C培养过夜，挑选白色菌 落 , 在 LB 液体培养基中增菌培养

21、。1.2.5阳性克隆的检测及核酸序列分析提取各阳性克隆的质粒 ，以质粒为模板 PCR 扩增 blaCTX-M 基因或 ISECTX 片段 ， 并对扩增产物进行凝胶电泳 ， 根据凝胶电泳图谱初步判断连接转化成功与否。 然后利用 T 载体的通用引物对阳性克隆进行核酸序列分析 ， 进一步确认克隆成功与否。最 后对测序结果进125 行比对分析。测序委托北京三博远志生物有限公司进行。1.2.6DHa CTX及 DH5a ISECTX克隆株blaCTX-M 基因表达水平分析利用TRIzol提取两克隆株的总RNA,按照逆转录试剂盒说明书，用引物P6、P7扩增 blaCTX-M-1 和 P8 、P9 扩增 1

22、6S rRNA 分别对两克隆株 RNA 进行RT-PCR扩增体系为50 fl l:Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 卩 l,2 x 1Step Buffer 25 m,10 mol/L 引物各 2 i l,Template130135RNA 3卩l,RNase free ddH20 17 i l;模板RNA经逆转录酶50 C反转录30 min,94 C初始变性2 min后进行PCR。PCR反应条件:94 C变性60 s,退火温度如材料中述 退火 45 s,72C延伸1 min,32 个循环;72 C延伸10 min。PCR完成后PCR扩增目的片 段 , 利用凝胶

23、成像分析系统检测每一菌株中的保守基因 16S rRNA 及 CTX-M-1 亚组 blaCTX-M 基因 RT-PCR扩增产物的扫描值 , 每一测量重复 3 次取其平均值 , 结果以 16S rRNA 的扫 描值为内参照 ,CTX-M-1 亚组 blaCTX-M 基因 RT-PCR 扩增产物的扫描值与之相比所得值 为其相对含量 , 比较 DH5 a CTX 及 DH5 a ISECTX 克隆株中 CTX-M-1 亚组 blaCTX-M 基因 RT-PCR扩增产物的相对含量。1.2.7统计学处理统计分析采用 SPSS 16.0软件包。比较 DH5a CTX及 DH5a ISECTX克隆株中140

24、blaCTX-M 相对表达量 , 用 t 检验, 以双侧 a 0.05 为显著性水准。1.2.8药物敏感试验对DH5a T、DH5x CTX和DH5a ISECTX克隆株进行药敏试验。采用纸片扩散法(discdiffusion test) 测定抑菌环 , 采用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度 (minimum inhibitionconcentration,MIC),参 照 美 国 临 床 实 验 室 标 准 化 协 会 (ClinicalandLaboratory Standards145Institute, CLSI) 颁 布 的 Methods for Dilution of Antibiot

25、ic Susceptibility Tests 进行。质控菌为大肠埃希菌 ATCC 25922。选用的抗生素分别是：选择头抱唑林(Cefazolin,CZ头抱噻吩Cefhalothin,CF、头抱呋辛钠 Cefurosimic Sodium, CXM 头抱西丁 Cefoxitin,FOX 头抱噻肟Cefotaxime,CTX头抱他啶Cefazidime, CAZ、头抱曲松 Ceftriazone, CRO、头抱吡肟 Cefepime, FEP 。-41501.2.8.1 纸片扩散法测定抑菌环方法步骤 ：1.2.8.1.1 接种菌液的制备 ： 用接种环挑取 LB 平板上单个菌落 , 接种于 LB

26、 液体培养基37C振荡增菌过夜，取少量菌液用LB液体培养基稀释100倍继续37 C振荡 培养 1 小时 ,用 LB 液体培养基逐步稀释 , 使得紫外分光光度计测定 OD600 值约为 0.080.12 之间 , 此时菌液浊度近似于0.5麦氏比浊管，约含12 xlO8CFU/m。将此菌液再稀释于 10 倍的 LB 液155160165170175180185体培养基中 ,15min 内接种平板。1.2.8.1.2 接种平板:用灭菌棉签沾取菌液 ,涂布整个 MH 培养基表面 ,反复 几次, 以保证涂抹均匀, 平放数分钟待其干燥。1.2.8.1.3 贴纸片 :用无菌镊子分别夹取不同的抗生素纸片 ,

27、贴在已接种细 菌的平板表面。每个10mm平板上贴5片不同的抗生素纸片,各纸片中心相距约24mm,纸 片距平皿边缘约15mm各纸片间距离相等。质控菌株 ATCC 25922以同样方法操作以作为对 照。128.1.4 孵育:37C培养18小时后读取结果。1.2.8.1.5 结果判定 : 用卡尺测量抑菌环直径 （包括纸片计算在内 ）, 抑菌环 的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。 按抑菌环直径判断细菌敏感、 中度敏感或耐药。 判 定标准根据 CLSI2012 年出版的抗微生物药物敏感性试验执行标准第二十二版信息增刊 M100-S22 判读。1.2.8.2 琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度 , 具体

28、步骤如下 :1.2.8.2.1 抗菌药物的配制和梯度浓度的制备 : 首先精确称量所需抗生素 , 用合适的溶剂溶解, 配制成含量为 5120 mg/L 的贮存液。然后用无菌去离子水再将贮存液 稀释成以下梯度浓度的工作液 :2560 mg/L、1280 mg/L、 640 mg/L、 320 mg/L、 160 mg/L、 80 mg/L 、 40mg/L、20mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L。工作液保存在 4 C冰箱 1 天 之内尽快使用如有需要额外配制更高或更低浓度的工作液 ) 。1.2.8.2.2 MH 平板制备：将高压灭菌过的 MH培养基冷却至60 C左右,取9mL

29、MH培养基,加入 1mL 特定浓度的抗生素工作液 ,充分混匀后,倾倒平板。制成的系列 梯度浓度的MH平板可保存在4 C冰箱,3天之内使用。1.2.8.2.3 接种菌液的制备 ： 用接种环挑取 LB 平板上单个菌落 , 接种于 LB 液体培养基 37 C振荡增菌过夜,取少量菌液用LB液体培养基稀释100倍继续37 C振荡培 养 1 小时 , 用 LB液体培养基逐步稀释 , 紫外分光光度计测定 OD600 值约为 0.080.12, 此时 菌液浊度近似于0.5麦氏比浊管,约含12 X 108CFU/m。将此菌液再稀释于10倍的LB液 体培养基中。1.2.8.2.4 接种:将制备好的接种菌液，15m

30、in内,用移液枪吸取1卩L的 菌液接种在事先制备好的含特定抗生素浓度的 MH 平板。每个板上划了 9 格内 , 每格接种 1 株志贺菌的接种液,每板接种 8 株菌,第 9 格接种药敏实验标准控制菌大肠埃希菌 ATCC 25922。12825 孵育：将接种好的平板放于 37 C恒温箱,培养18h20h后读取 结果。1.2.8.2.6 结果判 定： 根据临 床实验 室标准 化协会 (Clinical and Laboratory StandardsInstitute, CLSI)2012 年出版的抗微生物药物敏感性试验执行标准第 二十二版信息增刊M100-S22 判读。以完全抑制细菌生长的最低药物

31、浓度为被检抗生素的MIC。薄层极微弱生长或只生长 12 个菌落可忽略。空白对照培养基上应出现接近融合生长。 标准质控菌的 MIC应在允许范围内 , 否则该次实验结果不可取。-51.2.9ESBLs 表型确证实验采用 K-B 法用、头孢噻肟 / 克拉维酸钾 Cefotaxime/clavulanic acid,CTX/CA和头抱他啶/克拉维酸钾 Cefazidime/clavulanic acid, CAZ/CA、CAZ、CTX 药敏纸片对DH5x blaCTX-M190及DH5a ISECTX进行ESBLs表型确证。结果判读按 CLSI文件M100-S22 推荐的标准 ,实验标准控制菌为大肠埃

32、希菌 ATCC25922。2 结果2.1菌株鉴定临床分离志贺菌为福氏志贺菌 , 对头孢噻吩、诺氟沙星、庆大霉素、磺胺甲195唑四种抗生素均敏感命名为 mel-sf1998023/zz, 为头孢噻吩诱导的出发菌。2.2次抑菌浓度 1/2MIC 诱导耐药结果次抑菌浓度 1/2MIC 的抗菌药物能诱导细菌产生耐药早已有报道 6 。志贺菌 出发菌株初始菌的MIC为CF 16卩g/ml,将此初始菌在浓度为1/2 MIC CF的LB培养 基（ 即培养基中 CF为8卩g/ml）中传代20代，最终得到了 MIC 4倍诱导前的耐药菌株,是出 发菌株的 32 倍,200具体结果见表 1 。表1次抑菌浓度诱导志贺菌

33、出发菌株耐药结果MIC（卩 g/ml）药物诱导前药物诱导后第 4 代药物诱导后第 6 代药物诱导后第 8 代药物诱导后第 12 代药物诱导后第 16 代药物诱导后第 20 代对照第 1 代对照第 20 代头孢噻吩16326412819225651216162.3志贺菌 blaCTX-M 完整基因的 PCR 扩增结果对临床分离志贺菌出发菌株 mel-sf1998023/zz 和诱导耐药株 YDC 完整的 blaCTX-M 基因进行 PCR 扩增,均扩增出约 914bp 长度的片段 （图 1） 。-6-205图 1blaCTX-M 基因 PCR 扩增结果1:空白对照 2:mel-sf1998023

34、/zz blaCTX-M 基因 PCR 扩增结果3:YDC blaCTX-M 基因 PCR 扩增结果 4:100bp DNA ladder2102.4志贺菌插入序列 ISEcp1 和 ISECTX 片段的 PCR 扩增结果 对临床分离志贺菌出发菌株 mel-sf1998023/zz 和诱导耐药株 YDC 的插入 序列 ISEcp1 和ISECTX 片段分别进行 PCR 扩增。 mel-sf1998023/zz 和 YDC 均扩增出约 527bp 长度的片段 ,为插入序列 ISEcp1 的扩增产物。只有 YDC 扩增出了长约 1372bp 的片段 为 ISECTX 片段 （图2）。2152.5图

35、 2 插入序列 ISEcp1 和 ISECTX 片段 PCR 扩增结果1.7: 空白对照 ; 2:YDC 扩增 ISECTX; 3:mel-sf1998023/zz 扩增 ISECTX4:100bp DNA ladder 5:mel-sf1998023/zz 扩 增 ISEcp1; 6:YDC 扩 增 ISEcp1DHa T、DHa CTX和DH5a ISECTX的构建及检测提取各阳性克隆的质粒，以质粒为模板特异 PCR扩增插入基因片段，并对质粒和PCR扩220增产物进行凝胶电泳 , 经成像系统分析 , 说明阳性克隆制备成功图 3、图 4。 -7-图3DHa CTX阳性克隆检测结果注:连接转化

36、后进行蓝白斑筛选试验时 ,若连接不成功 ,菌落呈现蓝色 ;若连 接克隆成功 , 菌落呈现白色。1:100bp DNA ladder 2:blaCTX-M 基因 PCR 产物阳性对照 3:对 DH5a CTX 阳性克隆提取质粒进行 blaCTX-M225基因 PCR 扩增结果 4: 对蓝色菌斑提取的质粒进行 blaCTX-M 基因 PCR 扩 增结果;5:对DH5a T提取的质粒进行 blaCTX-M 基因 PCR 扩增结果图4DH5x ISECTX阳性克隆检测结果注: 连接转化后进行蓝白斑筛选试验时 , 若连接不成功 ,菌落呈现蓝色 ; 若连 接克隆成功 , 菌落呈现白色。2301:对蓝色菌斑

37、提取的质粒进行 ISECTX 片段 PCR 扩增结果2:对DH5a ISECTX阳性克隆提取质粒进行 ISECTX 片段 PCR 扩增结果 3: ISECTX 片段 PCR 产物阳性对照 ISECTX 片段 PCR 扩增结果 5:100bp DNA ladder4:对DH5a T提取的质粒进行2.6核酸序列分析结果对DH5a pCTX的插入片段进行测序后通过 NCBI的BLAST程序进行比对 发现与与235240Genbank 上 JX306031.1 序列中 blaCTX-M-55 的基因序列 100%同源, 长为876bp, 编码 291 个氨基酸。CTX-M-55属于CTX-M-1亚组。

38、对DH5a plSECTX克隆株的插入片 段 ISECTX 片段测序结果进行分析，该序列长1372bp,包含 DH5a pCTX中的 blaCTX-M-55 基因序列 , 另外 ,在该序列中发现 YDC 中 blaCTX-M-55 上游存在插入序列 lSEcp1, 此插入 序列提供 -35(TTGAAA及-10TACAA位点启动子,另有一个14bp的右侧反向重复序列 (IRR。此夕卜,右侧反向重复序列下游有一个5bp的富含AT的插入热点(TATTC),该ISECTX 片段序列已被提交到Genbank,序列号为KC138551,结果见图5。在该片段中可以看 出 ISEcp1 位于blaCTX-M

39、-55 上游,与其间隔 45bp, 在这 45bp 片段中没有启动子存在 ,而 在 blaCTX-M-55 上游的ISEcpl则可能能为其提供-35区TTGAAA-10区TACAA位点启动子，使其 能够高表达 ,从而促使该细菌对头孢菌素类抗生素产生耐药。-8245图 5 YDC 的 ISECTX 片段核苷酸序列示意图2.7DH5x CTX和DH5a ISECTX克隆株blaCTX-M 基因表达水平分析结果DH5x CTX及 DH5a ISECTX克隆株blaCTX-M基因表达水平分析均检测到片 段大小为551 bp 的 CTX-M-1 亚组 blaCTX-M 扩增产物 , 及大小为 803 b

40、p 的 16SRNA扩增产物图6。250255blaCTX-M基因表达水平的凝胶成像分析表明，DH5 a ISECTX克隆株blaCTX-M 基因表达的相对含量显著高于 DH5a CTX的相对含量（P0.05表2。图 6 DH5 a CTX和 DH5a ISECTX克隆株 blaCTX-M 基因 RT-PCR 结果1:空白对照 2:DH5 a pISECTX克隆株 blaCTX-M 基因和 16S rRNA RT-PCR 结果3:DH5a pCTX克隆株 blaCTX-M 基因和 16S rRNART-PCR结果 4:100bp DNA ladder表2 DH5a CTX和 DH5x ISEC

41、TX克隆株blaCTX-M基因表达水平比较x s克隆株DH5a pCTXDH5a pISECTXblaCTX-M基因相对表达量（以16S rRNA为参考）0.63110.02532.9770 0.2075注:t19.602P0.0022602.8药敏试验结果DH5x T、DH5x CTX和DH5a ISECTX克隆株纸片扩散法药敏试验结果见表 3:表 3 阳性克隆株纸片扩散法药敏试验结果 mm抗生素DHa TDHa CTXDH5a ISECTX-9-头孢噻吩 CF 头孢呋辛钠 CXM 头孢噻肟 CTX 头孢他啶 CAZ 头孢曲松 CRO 头孢吡肟 FEP 头孢西丁 FOX 注: 纸片直径 7m

42、m, 9273632353328表示无抑菌环9253128323028?102792225分别检测DH5a T、DH5x CTX和DH5a ISECTX克隆株对不同抗生素的最低抑 菌浓度(MIC)结果见表4。265表4阳性克隆株对抗生素MIC的测定卩g/ml抗生素头孢噻吩 CF头孢呋辛钠 CXM头孢噻肟 CTX头孢他啶 CAZ头孢曲松 CRO头孢吡肟 FEP头孢西丁 FOXDH5x T1640.0156250.50.06250.254DHa CTX3240.0156250.50.06250.254DH5a ISECTX2561024321612884由上述纸片扩散法药敏试验结果可见以 DH5a

43、T为对照,DH5a CTX与之相比各种药物耐药性无明显变化。而 DH5a ISECTX寸头抱呋辛钠CXM头抱噻肟CTX头 孢他啶CAZ头抱曲松 CRO头抱吡肟FEP的耐药性均增力卩;DH5a ISECTX与 DH5a CTX270275相比,头抱呋辛钠 头抱噻肟 头抱曲松 头抱吡肟的耐药性增加明显。由上述阳性克隆株对抗生素 MIC的测定结果可见以DH5aT为对照,各种药 物耐药性无明显变化。而DH5a ISECTX头抱噻吩提高8倍，头抱呋辛钠CXM提高256 倍 头抱噻肟CTX提高2048倍、头抱他啶CAZ提高32倍、头抱曲松CRO提高2048 倍、头抱吡肟FEP提高32倍;DH5a ISEC

44、TX与DH5a CTX相比，各药物MIC提高倍数同 DH5x ISECTX与DH5aT的比较结果。2.9ESBLs 表型确证实验采用 K-B 法用 CAZ、CTX CAZ/CA CTX/CA 药敏纸片对 DH5a T、DH5x pCTX 及DH5a plSECTX进行ESBLs表型确证。判读结果见表 5。 DH5x T和DH5 a pCTX头抱噻肟或头抱他啶两药物中没有任何一个加克拉维酸后抑菌环直径与不加克 拉维酸相比增大280值均w 5mm判定这两个克隆株不产 ESBLs。而DH5a pISECTX头抱噻肟或头孢他啶两药物加克拉维酸后抑菌环直径与不加克拉维酸相比增大值分别为 18mm 和 1

45、2mm 均 5mm,则DH5a plSECTXESBLs表型确认实验为阳性,判定其产ESBLs。所以,根据 表型确证实验结果判定只有DH5a plSECTX这一个克隆株产ESBLs。表 5 ESBLs 表型确证实验结果 mm- 10 -285抗生素头孢噻肟 CTX头孢他啶 CAZ头孢噻肟 / 克拉维酸 CTX/CA头孢他啶 / 克拉维酸(CAZ/CA)注: 纸片直径 7mmDH5x T36323531DH5x pCTX31282826DHa plSECTX101428263 讨论近 10 年来世界多个国家包括中国产 CTX 的肠杆菌科细菌广泛流行。与 SHV、TEM-ESBLs不同,CTX-M

46、-ESBLs既存在于医院感染临床株中又在社区感染菌 出现 , 如霍乱弧菌、非伤寒沙门菌、志贺菌等。CTX-M-ESBLs具有ESBLs的一般特征, 能水解头孢菌290295300305310315素、单环B -内酰胺类抗生素,对酶抑制剂敏感。CTX-M-ESBLs对窄谱头抱 菌素水解活性最高, 而水解青霉素类的活性不及 SHV 和 TEM-ESBLs7。近来发现插入序列 lSEcp1 及转座子可能与 CTX-M-ESBLs 的高表达有关8,9 。 插入序列 ISEcp1 属于 IS1380 家族 , 但其转座酶的氨基酸序列与 IS1380 仅有 25%的同源性。 ISEcp1B是 ISEcp1

47、 衍 生 而 来 , 有 文 献 报 道 ISEcp1B 插 入 到 肺 炎 克 雷 伯 菌 blaCTX-M-like 的前面为blaCTX-M-like 提供启动子和转位酶识别位点 , 使其高水平耐药 10 。目前志贺菌中 ISEcp1 参与的耐药机制仍不十分明确 , 可能是质粒、转座子、 插入序列等通过结合、转座多种形式实现的。本研究选择抗生素头孢噻吩来诱导临床分离的志贺菌敏感株。 通过诱导试验 使细菌通过抗生素选择压力从垂直方向获得耐药性 , 最终得到 MIC 是诱导前 6 倍的耐 药志贺菌菌株。本研究选用一株志贺菌敏感株作为出发菌株通过药物诱导产生诱导耐药株 , 排除菌株不同而导致的

48、差异 , 可比性较高。当仅有 blaCTX-M 存在时 blaCTX-M-55 表达水平 较低, 甚至达不到耐药水平, 本研究重点研究志贺菌敏感株通过头孢噻吩诱导成为耐药株前后插 入序列 ISEcp1和 CTX 型耐药基因 blaCTX-M 的位置变异及当诱导耐药后 ISEcp1 插入到 blaCTX-M 上游时可能对 blaCTX-M 表达水平的产生影响。 诱导耐药前后志贺菌中均能扩增出插入 序列 ISEcp1 和 CTX型耐药基因 blaCTX-M-55, 但诱导耐药前紧邻 CTX 型耐药基因 blaCTX-M-55 上游不存在插入序列ISEcp1, 而诱导耐药后插入序列 ISEcp1 插

49、入到 blaCTX-M-55 基因前面。且ISEcp1 编码区的下游发现了 -35启动子TTGAAA及-10启动子TACAAT,另有一个右侧反向重 复序列 (IRR是 转位 酶 结 合 位 点 。 随 着 ATG 起 始 编码 blaCTX-M-55 基 因 , 在 blaCTX-M-55 基因上游未发现其它启动子。DH5a ISECTX与 DH5a CTX相比,blaCTX-M 基因表达水平较高,且对 头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢吡肟的耐药性均增加。 提示诱导耐药后 ISEcp1 转座插入到blaCTX-M-55 上游, 为 blaCTX-M-55 提供了表达需要的启动子 , 使其高表达 导致细菌耐药。4 结论本课题通过对志贺菌敏感株诱导使其耐药 , 比较敏感株和耐药株 ISEcp1 与 耐药基因blaCTX-M 的位置关系 , 揭示了 ISEcp