重金属毒作用发展方向

1、重金属毒作用发展方向内质网是在细胞中由膜围成的亚细胞器，是一个连续的膜囊和膜管 网。真核细胞的内质网对大约 1/3 的新合成蛋白质实行修饰、折叠和 寡聚化，从而使之形成准确的构象，参与脂质代谢和类固醇激素的合 成以及钙的储存，因而内质网稳态的改变必将影响细胞功能，但细胞 机体也拥有一条适合性通路即内质网应激（endoplasmicreticulumstress , ERS来应对内质网功能紊乱 1。内质网应激能够由多种干扰内质网功能的病理生理改变以及其他环境因素 变化引起，如内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白或多余蛋白过多、 脂类或糖脂代谢失衡、内质网腔的氧化还原以及钙离子等离子条件的 改变，而

2、各种化学污染物也已成为重要的诱发内质网应激的外界环境 因素。在自然界，金属与两性金属的比重大约占80%。其中，一些金属（如砷、汞、铅、砣）只要在体内蓄积就会产生潜在的毒性；另一些 金属通过与氧、硫化物或氯化物形成化合物而具有毒性2。当前，金属污染严重是我国面临的主要环境问题。另外，在日常生活和职业活动 中，人们也不可避免地接触一定量的金属，但因为金属引起的毒性机 制尚不十分清楚，当前尚缺乏有效的防治方法。因而探讨内质网应激 与金属毒性的关系有助于探讨金属毒性机制，促动金属毒理学的发展。 本研究将以几种常见的金属（如铅、镉、汞及甲基汞、铝、铁、锰、 铬、镍、铀）作一综述，为揭示常见金属神经毒性下

3、内质网应激的发 生特点和开发相对应的化学保护剂提供参考资料。1 内质网应激及其相关的细胞应答信号通路ERS是指细胞内质网钙稳态失调或蛋白质加工运输障碍，引起生理功 能紊乱所致的一种亚细胞器应激反应过程。ERS可引起三种细胞应激效应：未折叠蛋白反应（UPR，内质网超负荷反应和固醇调节级联反应。 内质网应激通过激活这三条通路产生下游的五类内质网应激效应：（ 1） 诱导内质网葡萄糖调节蛋白78及94（GRP78及 GRP94等分子伴侣蛋 白的表达，促动错叠与未折叠蛋白恢复正常构象、维持内质网和胞质 Ca2评衡；（2）抑制蛋白质翻译，减轻内质网新生蛋白加工的负担；(3)激活NF-k B的效应，可能促动

4、抗炎反应；(4)影响脂类代谢， 进而可能影响生物膜合成；( 5)持续过强的内质网应激诱导细胞凋亡， 内质网既含有促动凋亡的因子如半胱氨酸蛋白水解酶 -12 (Caspase- 12)、生长停滞和DNA损伤诱导基因-153(CHOP/GADD153等，也含 有抑制因子如Bax蛋白抑制剂-1(Baxinhibitorl)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78、蛋白质二硫键异构酶(PDI)等。当内质网应激过强时， 促凋亡机制占主导，能够独立地诱导细胞凋亡，其中， Caspase-12 是 内质网应激致凋亡的特异性标志 3, 4。在三种ERS反应中，UPF最为 常见，研究也最为深入。UPRS过激活其下游三条

5、信号通路来应对相对 应的应激(图1)。UPR勺三条信号通路分别由三种类型的 ER驻留蛋 白起始：1型ER跨膜蛋白激酶(IRE1)、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER 激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)。IRE1信号通路：当内质网应激 发生时，IRE1蛋白与GRP7盼离，IRE1激酶结构域的反式自磷酸化活 化自身的内切核酸酶活力，然后内切核酸酶精确切割其唯一底物 酵母中人工染色体(mRNAHAC或多细胞动物中x-box连接蛋白 1(XBP1);剪接后，有活性的部分转位入胞核，协助伴侣蛋白的转录。 通过这个通路不但编码ER蛋白，折叠和修饰相关的酶，促动磷脂的合 成，还包括编码与膜泡运输相关的

6、蛋白，从而有利于非折叠蛋白的准 确折叠。PERK言号通路：PERK GRP7分离后，PERK激酶磷酸化真核 转录起始因子-2的a -亚基(elF2 a )，从而阻断蛋白合成，降低了去 往ER的蛋白量，最终减轻了 ER实行蛋白加工的负担。磷酸化的 eIF2 能够优先起始特定 mRNA勺翻译(如ATF4mRNA。而这种mRNAS因上的特殊结构起着重要的协调作用。ATF6信号通路:ATF6与GRP7盼离后，ATF6包被在膜泡中从ER转移到高尔基体中， 并在高尔基体内先后被S1P和S2P蛋白酶水解，释放胞质脱氧核糖核 酸结合区即ATF6f,然后ATF6f转位入核，激活基因表达。ATF6引起 内质网应激

7、元件基因启动子区域激活，转录出的蛋白包括伴侣蛋白 GRP78和 GRP94 蛋白二硫异构酶(proteindisulphideisomerase,PDI)、转录因子 CHO和 Xbox-bindingprotein1(XBP1，从而有利于内质网内非折叠蛋白恢复准确构象。2 内质网应激与几种常见人体非必需金属毒性的关系2.1 铅2.1.1 神经细胞在大鼠神经胶质瘤细胞（ C6 细胞）中，铅暴露可上调GRP78勺mRNA口蛋白水平的表达，这可能和 GRP78W铅可紧密结合， 将铅隔离于非毒性位点相关；这也可能是内质网应激对铅毒性的保护 机制6, 7。有研究发现，当以0.1和1卩mol/L的铅处理C

8、6细胞7d后, 其GRP78mRNA平上调到对照组的2.53倍；而当以10卩mol/L的铅 处理C6细胞7d后，Grp78mRN水平下调，与对照组相比减少 40%这 可能与高浓度铅抑制内质网应激相关；同时发现，经铅处理的 GRP78 蛋白水平具有剂量和时间效应 7。张莹等 8的研究结果显示，铅能够使 C6细胞的Grp78蛋白表达增加；在0.2卩mol/L铅染毒组中，染毒7和 30d的GRP7蛋白表达显著增高，其余各个时间点均无显著性变化；但 在1.0卩mol/L铅染毒组中，染毒1d后GRP781白表达量开始显著增 高，铅染毒30d时已达到铅染毒前的6.3倍；在2.0卩mol/L铅染毒组 中，0

9、.5h开始GRP781白表达量即显著增高，铅染毒 7d时达到高峰， 是铅染毒前的4.3倍，到30d时表达量又下降为铅染毒前的2.6倍。 这可能是因为高表达的GRP781白能与铅结合，将铅大量蓄积于神经 胶质细胞中，从而可能对更为敏感的神经元和其他细胞提供保护；但 在2.0卩mol/L铅染毒30d时，GRP781白表达量下降，说明在铅达到 一定浓度且在胶质细胞中蓄积到一定量后，细胞的整体功能受损，蛋 白质表达下降8。Qian等9采用Northern印迹方法分析1卩mol/L铅 处理原代培养两周的大鼠星形胶质细胞 1周后的GRP7基因表达，发 现处理组的GRP78基因表达与对照组相比明显上调。2.

10、1.2 血管内皮细胞铅（225卩mol/L ）处理血管内皮细胞24h后， 发现GRP78W GRP94&基因和蛋白水平上的表达上调，并具有剂量 -效 应关系；同时发现，经10卩mol/L铅处理后，GRP7和 GRP941白的表 达上调，并具有时间 -效应关系；同时，该研究进一步发现，铅可通过 c-Jun氨基端激酶-活化蛋白-1 （JNK-AP-1）通路引起血管内皮细胞中GRP7侨口 GRP9餐白的上调，这些内质网应激特异蛋白表达的上调提示 了内质网应激的发生 10。2.1.3NRK-52E细胞Stacchiotti 等11以肾小管细胞株 NRK-52E为模 型研究了铅诱导的肾中毒，发现 60和

11、300卩mol/L的氯化铅不能上调 Hsp72蛋白的表达，但能诱导 GRP7蛋白的表达上调，从而提示铅可选 择性诱导内质网应激的发生。在重组体肝癌细胞HepG2中，铅暴露也可诱导GRP78和GADD15基因启动子的上调，且具有剂量效应；在硝 酸铅浓度为100卩mol/L时，GRP78基因启动子上调到空白对照组的 3 倍 12。2.1.4 体内研究除了以细胞为研究对象外，也有研究通过建立低水平 铅暴露模型分析宫内和哺乳期低水平铅暴露对子代大鼠白细胞 GRP78 蛋白表达量的影响，探讨铅对内质网应激的影响，结果发现，母鼠从 交配前 30d 起每天被灌胃 1ml(10mg/ml) 乙酸铅溶液后，哺乳

12、期低水平 铅暴露致使内质网应激的标志性蛋白 GRP781白表达增加；提示母鼠 体内的铅能够通过妊娠和哺乳输送到仔鼠的不同器官，从而改变白细 胞GRP781白的表达；推测母源性血铅浓度的升高可改变幼鼠白细胞 中GRP781白的水平，这可能是铅影响免疫功能的机制之一13。2.2 镉2.2.1肾细胞Liu等14以LLC-PK1肾脏上皮细胞为研究对象评价了镉 对GRP78蛋白表达的影响，发现在用 10卩mol/L氯化镉处理的细胞中, GRP7蛋白水平在6h开始升高，并持续升高到24h;当用1 20卩mol/L的氯化镉处理细胞6h, GRP78蛋白的表达呈剂量依赖性增加； 同时，氯化镉处理引起 URP下

13、游激活蛋白ATF4和磷酸化elF2的增加 另外也有研究显示，在肾小球细胞中，内质网应激的标志性蛋白 GADD15的表达在镉暴露后4h开始上调，内质网相关的凋亡基因 Caspase-12 及下游的 Caspase-3 在镉暴露后 16h 被激活 15。2.2.2 肝细胞以内质网应激反应性碱性磷酸酶 (ERstress-responsealkalinephosphatase , ES-TRAP为内质网应激发生的灵敏生物标志物， Hiramatsu 等 16 分别从体内、体外两个方面探讨了重金属 （镉、钴、镍等）和内质网应激的关系：在体外试验中，以能够稳定 表达ES-TRAP勺大鼠肾脏NRK52E田

14、胞和小鼠肝Hepa-1c1c7细胞为模 型，给予氯化镉处理 6h 后，发现镉能够诱导内质网应激的发生，并且 表明ES-TRAP乍为重金属诱导内质网应激发生的标志物比其他内质网 分子伴侣标志物敏感；在体内试验中，以ES-TRAP转基因小鼠为模型,发现急性暴露氯化镉6h以后，肝脏和肾脏GRP78蛋白的表达显著增加, 并在24h恢复到正常水平，同时，急性镉暴露可导致血清ES-TRAP活力快速下降，与肝脏和肾脏中内源性内质网应激标志物的表达趋势相 反。2.2.3 其他研究有研究发现，15或30卩mol/L镉处理NIHSwiss小鼠 胚细胞（NIH3T3细胞）3、6、9、12h后，能够引起内质网结构发生

15、不 同水准地改变，使 Caspase-12 被激活，且呈剂量 - 反应关系；并可抑 制细胞基质内质网钙-ATP酶活力，诱导细胞凋亡，提示内质网与线粒 体共同参与镉诱导的细胞凋亡 17。同时，有研究发现，甲状腺细胞给予镉一次性处理后，再连续实行镉 处理则可增强内质网伴侣蛋白 GRP9啲诱导表达，且明显高于一次性 预处理和空白对照，这可能与镉预处理改变了细胞的敏感性，后续镉 的连续处理激活了细胞应激蛋白表达的镉特异性通路相关18。另外，Schroder等19以寄居蟹皮海绵为研究对象实行 0.01、0.1、1mg/L氯 化镉分别处理0.5、1、3、6d,发现寄居蟹皮海绵能够蓄积大量的镉， 导致DNA

16、单链断裂以及上调GRP78蛋白的表达，并且都具有时间-和剂 量-效应关系。2.3 汞和甲基汞在体外的研究中，Qian等7用氯化汞（Hg）处理C6细胞7d，发现 1卩mol/L的Hg就可引起GRP78mRNA平显著性升高，达到对照组的 2.5倍，但当处理浓度达10卩mol/L时，GRP78mRNA平显示了下降趋 势；就GRP78蛋白水平来说，1卩mol/L的Hg就可显著增加GRP781白 含量，染毒浓度为10卩mol/L的Hg则可使GRP781白含量达到对照组的2倍；为进一步探讨无机汞诱导 GRP78表达的机制，该研究采用凝 胶迁移实验（EMSA评价蛋白-DNA交互作用，发现经Hg处理细胞的抗氧

17、 化反应元件、激活因子和核因子 KappaB（NF-K B）与相对应蛋白的结合 水平增强，而且因为这些因子与抗氧化相关，因而提示氧化应激参与 了 Hg诱导的内质网应激反应。有研究发现，在甲基汞暴露1416h的凋亡细胞中检测到Caspase-12被激活，并发现内质网应激在甲基汞暴 露9h后发生，而在甲基汞暴露早期（23h）细胞内的活性氧增加， 提示内质网应激是发生在甲基汞细胞毒性的晚期事件，并且氧化应激 可能是诱导内质网应激的原因之一 20。2.4 铝Ghribi 等 21 研究发现，在兔腹腔注射含铝 25mmol/L 的 AlCl3 溶液 15d后，海马GADD15和转录因子NF-K的核转位增

18、多；同时，在内质 网和细胞核中，伴随着这两种蛋白的核转位， Bcl-2 的表达水平降低； 该研究还发现，铝暴露可激发内质网特异凋亡蛋白 Caspase-12 的活力。 张勤丽等 22研究发现，以 0.5、 1.0、 2.0mmol/L 氯化铝能诱导神经元 凋亡，并能引起内质网的变形肿胀及脱颗粒现象，提示铝对内质网可 产生应激效应。另外，在去除培养液中的钙离子和使用钙通道抑制剂 的情况下， Snyder 等 23 对麦芽酚铝的肝细胞毒性实行了研究，结果发 现，利用毒胡萝卜内酯促动内质网中的钙离子外流会降低麦芽酚铝对 肝细胞的损伤，从而提示内质网应激参与了铝的细胞毒性。3 内质网应激与常见人体必需

19、金属的关系3.1 铁在生物体内，铁是机体必需的微量元素，但铁过量会引起组织损伤。Lou等24以大鼠为模型，每天腹腔注射葡聚糖铁30mg/kg，持续9周,结果发现，与对照组相比，心脏和肝脏中GRP78S白表达量和Caspase-12活力上调；同时，一次性腹腔注射 300mg/kg葡聚糖铁，发 现在心脏和肝脏中GRP78S白的表达也显著上调，提示内质网应激在 铁引起的组织损伤中具有重要的作用。最近一项研究是以HepG2细胞 株为模型，利用氧化型二硫苏糖醇(DTT)和高半胱氨酸诱导其内质网应 激来揭示内质网应激对铁稳态相关基因表达的影响，发现伴随着非折 叠蛋白反应，由肝脏分泌的调节铁稳态的肝脏抗菌多

20、肽水平表现为二 相性：在非折叠蛋白反应早期，肝脏抗菌多肽水平降低；在应激反应 的持续阶段，肝脏抗菌多肽水平提升；这证明了内质网应激对于细胞 内铁稳态的意义 25。3.2 锰Chun等26以500卩mol/LMnCI2处理多巴胺能细胞株 24h，结果发现, 其诱导的黑质多巴胺能神经元 SN4741细胞的神经毒性由内质网应激反 应介导，诱导内质网的分子伴侣 GRP78蛋白水平升高，同时，激活内 质网的特异凋亡蛋白 Caspase-12。Oubrahim等27发现，0.5和 1.0mmol/L锰(II)作用24h可引起NIH3T3细胞凋亡的过程中，有 Caspase-12的参与；同时发现，在 Cas

21、pase-12基因敲除后，在 NIH3T3细胞中不发生凋亡，表明 Caspase-12在锰(I)引起的NIH3T3 细胞凋亡中起关键作用。3.3 铬当前，对铬与内质网应激关系的研究主要集中于对糖尿病的研究。一 些研究发现，内质网应激参与了铬提升机体糖耐量和减轻胰岛素抵抗 的机制。Sreejayan等28对肥胖小鼠实行D-型苯基丙氨酸铬Cr(D- phe)3 处理，结果发现，与空白对照组肥胖小鼠相比，处理组的内质网 应激的下游蛋白(p-PERK p-IRE和p-eIF2 a )的表达量减少，提示内 质网应激参与了铬对胰岛素抵抗的缓解作用；同时，该小组还研究了 在毒胡萝卜素诱导肌管产生内质网应激的情况下 Cr(D-phe)3 处理的影 响，发现在 Cr(D-phe)3 处理后，内质网应激的标记物 p-eIF2a 的表 达受到抑制，进一步提示调节内质网应激反应可能是铬的保护作用机 制。4 其他金属对于铀和镍等其他金属与内质网应激的关系也有一些研究，但主要是 描述内质网应激反应，未能实行深入的机制研究。贫铀在军事上的使 用使得关于贫铀毒性的研究越来越多，其中，Miller等29发现，550卩g/ml贫铀处理HepG2细胞48h，能够上调内质网应激的标志性蛋 白GRP78勺启动子并具有剂量依赖性。镍一般都是以镍合金的形式被 应用。有研究发现，镍合金的毒性比组成