聚氨基酸载体研究进展

1、聚氨基酸载体研究进展现代药物传递系统的研究离不开新型材料的使用 , 特别是药用高分子 材料, 壳聚糖、透明质酸、明胶、淀粉、海藻酸钠、白蛋白、纤维素、 聚乳酸、聚乙烯醇、丙烯酸类、聚酯、聚醚类等已在药剂学中体现出 独特的优势。但生物相容性、生物降解性和安全性制约了部分药用高 分子材料的使用 , 开发安全的且具有新型功能的高分子材料一直是药剂 学研究的热点领域。氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位 , 是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。选用一种或多种氨基酸合成 聚合物能在体内酶的作用下降解为氨基酸 ,生物相容性好 ,且安全无毒, 聚氨基酸的研究已受到广泛的注重。采用天冬氨酸、谷氨酸、赖氨

2、酸、 丙氨酸、苯丙氨酸等制备聚氨基酸是一类低毒、生物相容性好、容易 被机体吸收、代谢的生物降解高分子 , 在医药领域如药物控释、人造皮 肤等方面具有广泛的应用。当前聚氨基酸作为药物载体的研究主要集 中在聚氨基酸 - 药物偶联物、聚氨基酸复合载体、氨基酸共聚物几个方 面：聚氨基酸与药物通过化学键形成偶联物 , 在体内酸性环境及酶的作 用下化学键断裂释放药物 ,达到缓释、靶向的作用 , 并且能够降低药物 的毒性; 聚氨基酸与其他高分子材料形成复合载体以克服单一材料的不 足以及实现新的功能 ; 氨基酸共聚物亦可形成两亲性材料作为药物载体 以提升药物溶解性能 , 延长体内循环时间和实现靶向目的。1 聚

3、氨基酸 - 药物偶联物聚氨基酸含有活性氨基和羧基端 , 能够通过共价键与药物结合 ,形成偶 联物, 该偶联物在体内特定酸性环境及酶的作用下化学键断裂释放药物 达到缓释、靶向的作用 ,同时因为聚氨基酸的保护作用 , 能够提升药物 的稳定性 , 降低药物的毒性。聚氨基酸 -药物偶联物研究起始于上世纪 70年代初,美国犹他大学Kim领导的课题组曾成功地合成了聚谷氨酸材 料, 用氨基丙醇为侧链基 , 以共价结合方式与甾体避孕药炔诺酮形成偶 联物,并实行了体外及大鼠体内释放试验 , 其释药时间达 300余天。实 验结果表明 , 聚谷氨酸可降解为单体并不在生物体内滞留。聚氨基酸含 有活性羧基与药物通过酯键

4、结合是较为常见。另外聚氨基酸还能够通 过腙键与药物相连，因为腙键在低pH环境下时容易断裂，在肿瘤低pH 环境下靶向释放。聚氨基酸与顺铂通过配位键结合或与生物药物结合 可延长体内循环时间。但因为该类载体是通过药物与聚氨基酸共价键 偶联, 针对每一药物都需要设计合适的反应条件 , 并完成聚氨基酸 - 药物 偶联物的制备 , 增加了实施的难度、提升了成本 , 所以在应用上受到限 制。1 l通过酯键结合陈汐敏等 1 制备了新型天冬氨酸 -谷氨酸共聚物 -甲硝唑纳米粒 , 粒径 为198 - 9nm,载药量达12%,1h与24h体外累积释放百分率分别为 12 19呀口 47 51%戚晓红等2制备了聚天冬

5、氨酸-甲硝唑纳米粒，平 均粒径为404 8nm,载药量高达30%,24h体外累积释放百分率为 38 01%并能持续释放达30d,研究结果表明，聚天冬氨酸-甲硝唑纳米 粒显著提升甲硝唑对滴虫的抑杀作用。所以 , 聚天冬氨酸是一种非常有 潜力的载体。1 2通过腙键结合研究表明肿瘤组织pH低于正常组织,而肿瘤细胞内更是偏酸性，内含 体和溶酶体pH低至5 0,利用pH的不同设计pH敏感给药系统能够达 到靶向的目的。 Ponta 等 3 将 PEG-Pasppoly(ethyleneglycol)- poly(asparticacid) 共聚物的天冬氨酸羧基与氨基乙酸甲酯或 4-氨基 苯甲酸甲酯的氨基反

6、应再与肼反应后与阿霉素分子的羰基通过腙键共 价键链接 (腙键在弱酸环境易于解离 ), 研究表明 , 不同相对分子质量比 的氨基乙酸甲酯链接的聚合物 PEG-Pasp在pH50条件下药物释放均 明显快于pH7- 4,如PEG与 Pasp相对分子质量比为12 : 5,PEG相对分 子质量为12kD时，测定48h,pH74时药物释放30%,pH50释放40% 所以, 该释药体系可使 Dox 在低 pH 条件下快速释放而聚集于肿瘤部位。1 3通过配位键结合聚氨基酸与含金属元素药物之间通过配位键结合 , 在体内缓慢释放 , 延 长其体内循环时间。如NC-60044为PEG聚谷氨酸共聚物与顺铂的配位化合物

7、, 聚谷氨酸侧链羧基通过配位反应取代顺铂中氯原子后与铂原子 结合，顺铂从NC-6004中24h和96h分别释放19 6呀口 47 8%体内维 持较长时间血药浓度，体内AUCO-t和cmax分别是顺铂的65倍和8倍（1、4基因融合简单的多肽链能够形成与PEG类似的空间伸展构像，将蛋白与多肽链 融合,能够起到稳定蛋白的作用。多肽不但比 PEG能够提供更均匀同源 终端产物、避免生产过程中PEG的化学链接,而且多肽的长度能够根据 调整半衰期的需要精确调控。 Schellenberger 等5采用丙氨酸、谷氨 酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸制备多肽 36 氨基酸片断组成氨 基酸随机序列文库 , 最终

8、根据遗传学稳定性、溶解性、热稳定性、抗聚 集性、以及杂质（宿主细胞蛋白、DNA脂多糖）的多少，筛选出一种由 864 个氨基酸组成的多肽 , 将该多肽融合到新型降糖药 Exenatide 上, 使 其体内半衰期由原来的2 4h延长至139h。2聚氨基酸复合载体聚氨基酸与常用高分子材料通过化学键或物理作用结合形成复合载体 能够实现缓释、靶向、降低毒性、提升基因药物的转染率的目的。 PEG 与疏水性聚氨基酸形成两亲性聚合物 , 在溶液中可自动聚集成胶束 , 作 为药物载体 ; 聚赖氨酸带正电荷 , 与带负电荷的基因药物形成复合物 , 可 提升载药量和转染效率 ,接上相对应配体能够实现靶向目的 ; 亦

9、可选择 合适聚氨基酸与阳离子材料壳聚糖通过电荷作用形成复合载体。聚氨 基酸为两性离子 , 在不同 pH 条件下结构不同 , 亲水性能也不同 , 可与聚 乳酸-羟基乙酸共聚物形成pH敏感复合载体。另外，亲水性氨基酸有类 似PEG的性能,用以修饰其他材料后形成复合载体以达到长循环作用。 该类载体在应用时存有如下几个方面问题： 1）合成复合载体增加成本 , 如PEG与氨基酸组成复合载体，首先要将PEG的端基活化为氨基、羧基 等活性基团 , 增加了生产工序 ;2） 复合载体增大安全性风险：高分子材 料如聚乙二醇、壳聚糖、聚乳酸等存有一定的免疫原性 , 联合聚氨酸后 可能增强免疫原型 ;3） 复合载体的

10、载药性和降解性有待研究。因而这类 载体当前尚未见产品面世。2 l聚氨基酸与PEG组成复合载体聚乙二醇(PEG)具有柔韧的亲水性长链结构，又可生物降解，利用PEG 亲水性强 , 分子链柔性 , 能够包裹在聚合物胶束、脂质体或纳米粒等表 面, 从而使微粒给药制剂避开单核吞噬细胞的吞噬 , 达到长循环作用。 利用聚氨基酸所带电荷不同、聚氨基酸的残基亲水性不同与PEG偶联后以达到提升载药量、缓释、降低毒性或制备成pH敏感型载体。Prompruk等6以PEG为亲水段，天冬氨酸与苯丙氨酸(Phenylalanine) 合成的聚合物作为疏水段 , 形成嵌段共聚物。天冬氨酸能够通过离子作 用包载药物 , 而苯

11、丙氨酸的疏水性或者芳环相互作用有利于胶束形成 , 减缓胶束解离 , 延缓药物的释放。制备的 PEG-P(asp-phe)( 相对分子质 量比5 : 6 : 4)包载亲水性药物三氮脒，4h内释放35%并可维持12h缓 释。Wang等7合成mPEGf聚N-氨基酸基-DL-天冬酰胺接枝共聚物制备纳 米胶束,用于包载药物顺铂,结果可维持40h缓慢释放,并且可降低对 Bel-7402 细胞的毒性。选用带正电荷的赖氨酸 (lysine) 包载基因药物 , 以提升包封率和转染效率等是聚氨基酸应用研究热点之一。 Park 等 8 研究PEG接枝或共聚L-赖氨酸(polyL-lysine,PLL)后通过物理吸附

12、包裹在腺病毒表面 , 因为血清蛋白表现负电性 , 可通过离子交换作用使 PLL-g-PEG去PEG化,而药物释放腺病毒，再通过CAF中介的细胞内吞作 用进入细胞 , 结果包裹的腺病毒相对表达水平最高达370%。所以 , 能够通过简单的物理包裹病毒 , 以提升转染率 , 减少先天免疫反应。Choi等9制备PEG聚(谷氨酸-苯丙氨酸)载质粒DNA复合物,转染效 率是聚赖氨酸的80倍,细胞毒性试验结果显示，使用PEG聚(谷氨酸-苯 丙氨酸 ) 细胞存活率达 95%,而使用聚赖氨酸或者聚乙烯亚胺的细胞存活 率分别为 65%和 55%。采用聚氨基酸与PEG共聚作为抗肿瘤药物载体有 NK01210已实行I

13、期 临床研究,NK105已实行H期临床研究11。NK105为PEG聚天冬氨酸共 聚物, 通过疏水作用物理包裹紫杉醇 , 注射后血浆药物浓度能够维持 72h, 而单用紫杉醇24h后就已经检测不出；用药后5min血药浓度及AUC分 别是紫杉醇的 1120倍和 5086倍; 临床应用胶束 ( 相当于紫杉醇 25mg/kg)抗肿瘤活性与100mg/kg紫杉醇疗效相当。NK012为PEG聚谷 氨酸共聚物包载 7-乙基-1 0-羟基喜树碱 (7-ethyl-10-hydroxy-CPT,SN- 38),单用SN-38注射后浓度呈对数式速度下降，而HT-29肿瘤中使用 NK102SN-38勺清除率显著降低,

14、SN-38浓度维持在30ng/g长达168h,并 且NK102在小鼠体内的网状内皮系统表现高度聚集。22与相对应配体结合聚氨基酸-PEG与相对应配体结合能够实现靶向的目的。Kim等12制备聚赖氨酸-PEG两亲性嵌段共聚物，并以叶酸(folicacid,FOL) 修饰 PEG形成带正电PLL-PEG-FOL聚合物，带负电荧光标记的牛血清白蛋白 (FITC-BSA)与PLL-PEG-FO形成聚电解质复合物，应用于叶酸受体过表 达KB细胞,该体系FITC-BSA表现出高摄取，结果证实提升摄取是由叶 酸受体产生的。试验者采用叶酸受体缺乏细胞A549研究表明,PLL-PEG-FOL/FITC-BSA摄取

15、量并未增加，所以证实该给药体系能够通过叶酸 受体达到靶向的目的。Liu等13采用树状接枝聚赖氨酸-PEG-30肽(DGL-PEG-Leptin30,Leptin是内源激素衍生物，作为脑靶向配体)与血浆DNA制备纳米粒, 运载基因药物穿过血 -脑脊液屏障达到脑靶向作用。研究表 明,DGL-PEG-Leptin30在体外实验中能够穿越血-脑脊液屏障模型，而静 脉注射后能够在小鼠的脑内聚集。总来说之 ,DGL-PEG-leptin30/DNA 是 相当安全有效的脑靶向基因传递系统。23与壳聚糖形成复合载体壳聚糖是由自然界广泛存有的几丁质经过脱乙酰作用得到的阳离子聚 多糖, 而氨基酸表现为两性离子 ,

16、 在生理条件下 , 不同氨基酸可表现为阳 离子型或阴离子型 , 选择合适氨基酸能与壳聚糖通过静电作用形成分子 间聚合物。Shu等14制备水溶性壳聚糖(water-solublechitosan,WSC) 聚天冬氨酸-PEG复合物(WSC/Pasp-PEG)包载牛血清白蛋白，载药量最 大可达40注右，包封率最大90%左右。模拟体内环境pH12、25和 74条件下体外药物释放研究，释放速度pH7 - 4pH1- 2pH2- 5,这是 因为pH12时Pasp的羧基以-COOH形式存有，WSC与Pasp之间的静电 作用力减弱，复合物不稳定，破裂后药物释放。在pH74时WSC勺去离 子化，导致纳米粒崩塌

17、，药物快速释放；空腹胃内pH(pH2- 5)时，药物缓 慢释放。所以 , 建议餐前服用。24与聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成复合载体聚乳酸-羟基乙酸共聚物也是药剂学中常用高分子材料 ,常作制备微球 的材料。Yang等15将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚谷氨酸共聚(PLGA- b-PGA),制备成pH敏感聚合物,在pH39范围内，随着pH升高,该聚合 物依次呈紊乱形态(pH3)、胶束(pH5)、伴有厚壁的半囊泡(pH7)、囊泡 (pH9),所以，能够通过环境pH改变控制药物释放。25与聚乙酰亚胺形成复合载体聚乙烯亚胺富含氨基，可与DNA链上负电性的磷酸根通过静电作用缔 合成复合物，在此过程中，DNA会被

18、高度压缩成50200nn大小的纳米球， 大大增强了对细胞膜的穿透作用 ,所以具有较高的转染效率 ,是当前研 究较多的聚阳离子型基因载体。陈丹等 16 以天冬氨酸、谷氨酸为单体 , 经过聚合后作为母体骨架 , 将低分子聚乙酰亚胺偶合于母体上 , 作为 DNA 药物的载体 , 转染效率是聚乙酰亚胺的两倍 , 并且体外细胞毒性并没有 增加。26聚氨基酸作为亲水修饰材料应用虽然PEG通常被用来作为亲水性修饰材料，但PEG修饰的过程增加了 制剂的成本和产生了杂质17-18,PEG修饰后在动物模型反复用药后表 现出肾小管空泡，而且PEG的空间位阻限制了载体的细胞摄取。另外， 应用PEG后在动物和人体也会产

19、生抗体19。所以,研究人员尝试采用亲 水性氨基酸来代替 PEG。Romberg 等 20 分别用摩尔分数为 5%的聚羟乙基 L- 天冬酰胺 poly(hydroxyethylL-asparagine,PHEA,相对分子质量 3kD、聚羟乙基L- 谷氨酰胺 poly(hydroxyethylL-gluta-mine),PHEG, 相对分子质量 4kD修饰脂质体，并比较其半衰期，未包裹脂质体半衰期9 7h,用聚天 冬氨酸、聚谷氨酸包裹的脂质体半衰期分别为14 4h和11 9h。组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶 E都能使PHEA和PHEG笔解,并且 修饰后脂质体体外激活补体水平大大降低,PHEA

20、修饰的脂质体激活水准 小于PHEC修饰的脂质体。Romberg等21随后验证了聚(羟乙基L-谷氨酰胺)-N-琥珀双十八烷基 胺包裹脂质体 , 能够对以二油酸磷脂为主要组成的脂质体起稳定作用 , 并且因为脂质体外层包裹的聚氨基酸脱落能够控制药物释放。Schlapschy等22证明通过聚氨基酸修饰 HER-2抗体Fab段4D5,能够 显著延长体内循环时间。4D5半衰期仅为05h左右,而采用甘氨酸丰 富的均聚氨基酸(Gly4Ser)n 100或200个重复单元修饰4D5后,其半衰 期分别为2 1h和5 7h。以上研究表明 , 采用亲水性氨基酸同样能够达到长循环作用 , 从而避免 了 PEG勺不良反应

21、。3 氨基酸共聚物采用一种或几种氨基酸合成聚合物作为药物载体 , 其代谢产物对人体 无毒, 比其他高分子材料具有更高的安全性 ,氨基酸来源丰富 ,价格便宜 , 组成人体氨基酸有 20 种, 能够根据需要选择 , 满足不同药物载体的需要 , 聚氨基酸分子链上具有很多活性基团 (如：氨基、羧基 ), 药物或活性物 质能方便与之结合 , 所以聚氨基酸作为药物载体也越来越受到注重。聚 氨基酸作为药物载体在应用时应该注意：1) 聚氨基酸在体内降解为氨基酸 , 要注意克服由此带来的不良反应 ,如 患有苯丙酮尿症病人不宜使用含苯丙氨酸的载体 ;2) 氨基酸在一定条件 下带有电荷 , 选用带不同电荷的氨基酸制备药物载体要防止因为电荷吸引而导致的载体的聚集 ;3) 氨基酸形成聚合物聚合度高时会出现溶解性 问题。韩亚冬等23以聚L-谷氨酸为载体材料，采用无水乳液法制备口服胰岛 素微球,微球直径在520卩m,载药质量分数为5%9%载药微球具有良 好的pH敏感释放行为，在胃模拟液中2h释放量约为5%在肠道模拟液 中2h释放90%以上,所以,能够使胰岛素靶向于肠道释