人教版高中生物选修一专题五《DNA和蛋白质技术》知识点归纳

1、专题五DNA和蛋白质技术课题一D N A的粗提取与鉴定一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面1 .DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点要使0?DNA溶解，需要使用什么浓度要使 DNA析出，又需要使寒,用什么浓度蟹/在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使 DNA溶解； ，度I0.14mol/L可使DNA析出。曲11浓?； V 在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl 亘 飞9溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有 DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸储水，以稀释 NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但 DNA

2、 却不能溶于酒精（特别是95%冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。2 .从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止 DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。3 .采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的 将DNA和蛋白质进一步分离。,4.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原 理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对 DNA产生影响温度值为6080C,因为该温度值蛋白质变性沉淀，而 DNA不会变性。补充：DNA的变性是指DNA分子在高

3、温下解螺旋，其温度在 80c以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95Co5 .洗涤剂在提取DNA中有何作用洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。6 .当鉴定提取出的物质是否是 DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定在沸 水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。原理总结：通过利用不同浓度 NaCl溶液溶解或析出DNA,可以从细胞中提取和提纯 DNA ;再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。二、实验材料的选取不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材 料易得、便于提取的原则。本实验用鸡血细胞做实验材料有两个

4、原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和 离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA,容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为 了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。三、破碎细胞，获取含DNA的滤液1、若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含 DNA的滤液在鸡血细胞液中加入一定量蒸储水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋 葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。2 .为什么加入蒸储水能使鸡血细胞破裂答：蒸储水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分可以大

5、量进入血细胞内， 使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂 （细胞膜和核 膜的破裂），从而释放出DNA。3 .在以上实验中，加入蒸储水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么过滤时应 当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸储水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞 膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。4 .在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么研磨不充分产生什么结果破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提 取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。具体做法。10mL鸡血+ 20mL蒸储水一同方向搅拌一 3层尼龙布过滤一滤液

6、三、去除滤液中的杂质1.为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓 度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出 DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是 蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA ;方案三的原理是蛋白质和 DNA的变性温度不 同。方案二与方案三的原理有什么不同答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白， 从而使提取的DNA与蛋白质分开； 方案三利用的是DNA和蛋

7、白质一对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与 DNA分离。四、析出与鉴定1 .在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢得到的DNA呈何颜色滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置 23分钟，析出的白色丝状物就是 DNA。DNA呈白色。2 .怎样鉴定析出的白色丝状物就是 DNA呢具体做法。试管2支，编号甲乙一各加等量5mLNaCl溶液 一甲中放入少量白色丝状物，使之溶解一各加 4mL二苯胺，混 合均匀一沸水浴5min一观察颜色变化五、实验操作制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心 破碎细胞，释放DNA 加蒸储水，同一方向快速通方向搅拌，一过滤，除去细胞壁、细胞膜等。溶解核内DNA 加入NaCl至

8、2mol/L ,同一方向缓慢搅拌DNA析出 加蒸储水至0.14mol/L,过滤，在溶解到2mol/L溶液中J 一除去细胞质中的大部分物质。DNA初步纯化 与等体积95%冷却酒精混合，析出白色丝状物AF，一除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓 度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢(细 胞破裂快速搅拌)；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。课题二 多聚酶链式反应扩增DNAt段基础知识PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：1 .细胞内DNA复制条

9、件分析：条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核甘酸一合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋 催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起 点2 .细胞内DNA复制过程的解析：解旋：解旋酶、ATP, DNA两条链打开，形成两条 DNA单链。引物结合：在DNA单链3端与DNA反向配对结合。DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始。子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核甘酸连接起来。后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的 DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子

10、链连接起来(半不连续合成。先导链，滞后链)3 . DNA分子复制的人工控制实验操作步骤照PCR反应体系配方配制反应液；将PCR反应体系50仙L用微量移液器转移到微量离心管(0.5mL)中;将微量离心管放到PCR仪中；设置PCR仪的工作参数。DNA在PCR仪中大量扩增。,4 .实验注意事项1 1)避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸储水等使用前高压灭菌。2 2)缓冲液和酶分装r成小份，-20c低温保存。3 3)每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。4 4)混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。总结、点评多聚酶链式反应课题三血红蛋白的提取和分离一、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小

11、、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。5 .凝胶色谱法(分配色谱法)：(1)原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。(2)凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。(3)分离过程：混合物上柱一洗脱一大分子流动快、小分子流动慢一收集大分子一收集小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。(4)作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。6 .缓冲溶液(1)原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3NaHCO3, NaH2PO4/N&H

12、PO4等)，调节酸和盐的用量，可配制不同 pH的缓冲液。(2)缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液 pH的干扰而保持pH稳定。7 .凝胶电泳法：(1)原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同,在电场中受到的 作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度 不同。(2)分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。(3)分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷 多的SDS,形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大 小。二、实验步骤1 .样品处理红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分 离

13、红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆， 将下层暗红色的红细胞液 住倒入烧杯，再加入五倍.体积的生理盐水,缓慢搅拌10min,低速短时间离心， 如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放在蒸在水和甲苯作用下、红细胞破裂释放出血红蛋白。注：加入蒸储水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶 解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。2,粗分离分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为 4层。第一层为无色透明的 甲苯层,第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液 体.这是血红窜白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉

14、淀物。 将试管中的液 体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色 透明液体。透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有 300mL的物质的 量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中,透析12h。透析可以去除样品中分子量 较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。3 .纯化调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下 降到与凝；胶面平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，I打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，J关闭出口。调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液

15、到适当高度洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。4 .纯度鉴定-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）三,、注意事项电泳技术电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分 子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度， 从而达到对 样品进行分离、鉴定或提纯的目的。5 .红细胞的洗涤如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。止匕外，离 心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀， 也得不到纯净的红细 胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。6 .如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功由于凝

16、胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的 日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。止匕外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、 狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻 敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。7 .为什么凝胶的装填要紧密、均匀如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。8 .沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。9 . G-75“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。7 .装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密8 .加入柠檬酸钠有何目的为什么要低速、短时离心为什么要缓慢搅拌防止血液凝固；防止白,细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。9