基于生物反应器探究制药废水中活的但非可培养状态细菌的组成

1、基于生物反应器探究制药废水中活的但非可培养状态细菌的组成 摘 要：目的 分析制药废水中活的但非可培养状态细菌的组成。方法 以采集的制药废水为研究对象，经处理后，利用mpn法分离vbnc状态细菌，并利用rpf诱导，分析vbnc状态细菌的组成。结果 制药废水中，存在具有优势的、敏感于rpf的vbnc菌群，其组成包含革兰式阳性放线菌、革兰氏阴性菌等。结论 vbnc状态细菌存在于制药废水中，为深度处理制药废水方法的研制提供参考。 关键词：生物反应器 制药废水 活的但非可培养状态细菌 中图分类号：g8 文献标识码：a 文章编号：1672-3791（2017）04（a）-0245-02 近年来，人们不断提

2、升药品需求，促使制药行业快速的发展，由此也增加了制药废水的排放量。在制药废水中，盐、难溶化合物、有机物、无机物等均包含其中，且具有比较高的化学需氧量，处理时，无论是化学法或是物理法，都难以有效处理，因此，制药废水处理研究中，热点问题即为微生物处理技术的开发1。该文以微生物学为切入点，分析制药废水中vbnc状态细菌的组成，现报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 制药废水：采集于制药公司，尚未进行处理，置入生物反应器中，分别进行30 d、61 d、183 d及361 d的连续流运行，在生物反应器最初出水段的三点分别进行取样，折算为干重后，共3 g，于100 ml锥形瓶中放置，将蒸馏水27 ml

3、加入其中，进行20 min的搅拌，保证充分混匀，制成悬液待用。 试验菌种：藤黄微球菌，来源于分子细胞生物学研究所，制备菌种dna，按照规定方法进行，将其rpf基因确定，同时，保证其表达于大肠杆菌中。 主要仪器及试剂：pcr反应扩增仪、凝胶成像系统、uniq-10柱式细菌基因组dna抽提试剂盒等。 1.2 方法 1.2.1 制备培养基 反硝化细菌培养基选择为mpn培养系液体培养基，高压灭菌15 min；由pym培养基作为mpn培养系分离纯化培养基，高压灭菌15 min。 1.2.2 mpn法和mpn培养系 样品中，可培养细菌总数的统计利用mpn法、mpn培养系进行。培养容器选择为透明玻璃瓶，容量

4、2.55.0 ml，于液体培养基中加入10%制备液（其中含有rpf），作为实验组，于另外液体培养基中加入10%制备液（不含rpf），作为对照组，稀释10%的样品悬液，浓度梯度为10倍，直至106停止，实验组与对照组均分别进行3次，静置培养时温度维持在30。以生物反应器运行时间为依据，将两组吸光值的变化（od660）测量出来，同时，结合肉眼判断，将两组培育液混浊情况准确记录，有混浊为阳性，否则为阴性。根据mpn值，查出两组细菌总数。 1.2.3 判断rpf阈值、vbnc状态菌 rpf阈值为实验组细菌总数与对照组细菌总数的比值。rpf阈值在5以上时，实验组最前方培养液经稀释后表现为混浊，为阳性，对

5、照组为阴性，稀释平板分离实验组培养液后，可得到单位样品中总数属于优势的vbnc状态菌；rpf阈值为51时，稀释平板分离两组最前方混浊培养液，对细菌落形态特征存在的差异做出判断，特征性菌落为实验组特有时，表明vbnc状态细菌敏感于rpf。 1.2.4 分离菌株 依照相应的试剂盒说明书进行vbnc状态细菌dna的提取，并进行pcr扩增，分析分离出来的菌株。 2 结果 2.1 mpn值与样品细菌总数 生物反应器运行时间不同时，实验组和对照组的mpn值、细菌总数见表1。经计算可知，运行30 d时，vbnc状态菌复活率为94.1%；运行61 d时，vbnc状态菌复活率97.9%；运行183 d时，vbn

6、c状态菌复活率为55.1%；运行361 d时，vbnc状态菌复活率为48.0%（vbnc状态菌复活率=（实验组细菌总数-对照组细菌总数）/实验组细菌总数100%）。见表1。 2.2 rpf阈值、od660值 由rpf阈值可知，处于优势的、敏感于rfp的vbnc状态菌存在于单位样品中。由od660值可知，实验组均高于对照组，rpf具有刺激细菌生长的作用。 2.3 菌株分离结果 实验组经培养分离后，在分离中，发现包含丰富的菌株类型，主要楦锢际窖粜苑畔呔、革兰氏阴性菌。 3 讨论 在制药行业生产过程中，会产生大量的制药废水，属于有机废水，浓度比较高，降解难度大。现阶段，主要包含6种制药废水，分别为化

7、学合成类、发酵类、提取类、传统中药类、混装制剂类、生物工程类，其中，占据比重比较大的为化学合成类和发酵类，这两类的污染程度也比较高2。基于制药废水的特殊特点，行业研究的热点问题之一即为开发出高效的微生物处理技术，以能有效地处理制药废水。 该研究中，实验组细菌培养时加入了含有rpf的制备液，对照组加入的制备液中则不含有rpf，结果显示，实验组的细菌总数多于对照组，而且od660值也高于对照组，这说明，rpf蛋白能够刺激部分细菌菌种的生长。此外，经分离实验组vbnc状态细菌后，得到的菌株类型包含革兰式阳性放线菌、革兰氏阴性菌等，均属于近缘菌。实际上，采用普通方法培养细菌时，这些细菌并无法获取，不过利用rpf蛋白诱导后，改变了细菌的vbnc状态，变为可培养状态，从而被分离出来，这表示，rpf蛋白能够复苏、刺激革兰氏阳性菌及阴性菌生长的作用。 综上所述，制药废水在生物反应器作用下，经rpf蛋白的诱导，能够分离出处于vbnc状态的细菌，并能刺激其复活、生长，有利于深入的认识其中vbnc状态细菌的组成，为微生物处理技术的开发提供参考。 参考文献 1 康得军，