钒酸氧化法和重氮法检测胆红素的方法学评价

1、钒酸氧化法和重氮法检测胆红素的方法学评价 摘要 目的:寻找一种精密、准确、使用方便且特异的检测血清总(直接)胆红素的方法。方法:对钒酸氧化法和重氮法进行方法学评价,包括精密度、线性范围、准确度、方法比较和干扰因素。结果:两种方法检测总(直接)胆红素的精密度和准确度均符合要求,两种方法检测结果有良好的相关性(tbil:r=0.997,dbil:r=0.987,均符合r0.975)同时有极显著性差异(p 关键词 钒酸氧化法;重氮法;胆红素;方法学评价 中图分类号r446.11 文献标识码 b文章编号 1673-7210(2009)07(b)-072-02 血清胆红素作为肝胆疾患等诊断的重要指标已广

2、泛应用于临床1-3,但长期以来,标本溶血对测定的干扰影响一直未能得到很好解决4。目前,测定血清总胆红素(tbil)和直接胆红素(dbil)的方法包括重氮试剂法(如改良j-g法和m-e法等),胆红素氧化酶法和化学氧化法(如钒酸氧化法)。重氮试剂法存在反应不专一、易受溶血和脂血干扰的弊端,使检测结果出现偏差,有时甚至出现直接胆红素高于总胆红素的错误结果,而且这种方法存在工作液不够稳定的缺点5。胆红素氧化酶法由于酶试剂成本昂贵,需要有高效热稳定的酶及其促进剂抑制剂,影响了其在实际工作中的应用6。1993年日本学者tokuda7建立了钒酸氧化法测定血清胆红素。建立一个新的分析方法,或引进新的方法、试剂

3、和仪器,都应对它们的技术性能如精密度、方法比较、线性范围,以及干扰等作出评价8。为了寻找一种精密、准确、使用方便且特异的检测血清总(直接)胆红素的方法,本文对钒酸氧化法和重氮法进行了方法学评价,现总结如下: 1 材料与方法 1.1 仪器 日本日立公司hitachi 7060型全自动生化分析仪,日本东亚公司sysmex kx-21型全自动血细胞分析仪。 1.2 试剂盒 1.2.1钒酸氧化法试剂:由北京中生北控生物科技股份有限公司提供液体双试剂,直接上机使用。 1.2.2 重氮法试剂(选用酒精为加速剂):由波音特生物科技(南京)有限公司提供双试剂,临用前配成单试剂使用。 1.3 胆红素标准品 由卫

4、生部上海生物制品研究所提供8 840 mol/l的胆红素标准液,临用前10倍稀释成884 mol/l。北京中生北控生物科技股份有限公司提供的胆红素配套校准品。 1.4 室内质控品 由英国朗道公司(randox)提供。 1.5 血红蛋白液 收集体检患者正常新鲜的edta抗凝全血标本,用生理盐水洗涤红细胞4次,离心去除上清液,加入适量蒸馏水溶解红细胞,用血细胞分析仪测定血红蛋白浓度,配制成80 g/l的血红蛋白液。 1.6 标本来源 门诊、体检科或病房早晨随机采集的患者空腹静脉血。 1.7 测定方法参数 按全国临床检验操作规程9和各厂家胆红素试剂盒使用说明书要求,分别编制各方法实验参数。 1.8操

5、作方法 所有静脉血标本采集后送到检验科,及时离心和分离血清,备用。使用两种方法试剂用胆红素配套校准品对全自动生化分析仪进行统一定标,做室内质控在控后按美国国家临床实验室标准化委员会(nccls)制定的评价方案8,10 分别进行5项方法评价试验,并统计分析精密度、线性范围、准确度、方法比较和干扰因素。 2 结果 2.1 精密度 选择2个标本(一个正常值,一个高值),每天测定2次(2次测定间隔2 h以上),每次测定均做双份, 共测定20 d,每次测定时做质控。用两种方法测定的所有双份数据未发现离群点,两种方法平均cv(%)表示,结果见表1。 表1 钒酸氧化法和重氮法检测tbil和dbil的精密度结

6、果(%) 2.2线性范围 取患者低值混合血清为1号,取患者高值混合血清为5号,低高值31混匀为2号,等量混匀为3号,13混匀为4号, 每个标本均用两种方法测定tbil和dbil 4次。取其均值为测得值(y),与设定值(x)的直线回归方程和相关系数如下:钒酸氧化法tbil为y=1.000 2x+0.005 37,r=0.999 6,dbil为y=1.000 3x+0.004 32, r=0.999 4,重氮法tbil为y=1.000 5x+0.002 41,r=0.999 2,dbil为y=1.000 5x+0.002 64,r=0.999 5;本试验两种方法tbil和dbil测定数据均未发现离

7、群点,稀释变异均为可接受(p 2.3 准确度9 制备两份不同tbil或dbil浓度的患者混合血清样本作为基线标本,向9.6 ml的血清中分别加入0,100,400 l总胆红素浓度为884 mol/l的标准液或直接胆红素浓度为250 mol/l的患者血清,再分别加入400、300、0 l生理盐水,对每一种情况最后的体积为10.0 ml,均使用两种方法做4次重复检测,并计算每一标本4个单独值的平均值。通过测量值减去各自原血清含量确定回收量,百分回收是回收量除以加入量乘以100获得。计算4个回收率的平均值得到一个平均回收率,钒酸氧化法:tbil为101.3%,dbil为102.2%;重氮法:tbil

8、为103.8%,dbil为104.7%。 2.4 方法比较 准备48个新鲜且tbil或dbil含量不同的患者标本,每天测定8个标本,每个标本用两种方法分别作双份测定,双份测定时第一次按顺序1,27,8,第二次8,72,1,共测定6 d,将数据保存并整理。tbil和dbil两种方法内双份测定数据均未发现离群点,两种方法间亦未发现离群点,两种方法测定tbil和dbil结果的平均差数经配对t检验,均有显著意义(p 2.5 干扰因素 2.5.1溶血:采用配对t检验,取一份用黄疸患者血清混合而成的中值混合血清,分成2份,每份含0.9 ml,其中一份加入0.1 ml 80 g/l血红蛋白液为测定(高值)标

9、本5号,另一份则加入0.1 ml的生理盐水作为对照(低值)标本1号,按线性比较的方法准备5个不同的浓度, 5份标本均用两种方法分别重复测定tbil和dbil 4次, 其中1号标本重复测定20次,计算15号标本平均值和1号标本标准差,干扰值(25号)=25号标本平均值-1号标本平均值,干扰值大小在对照标本95%可信限(1.96s)范围内判断为无显著性干扰(即干扰无统计学意义),否则为有显著性干扰(即干扰有统计学意义)。试验结果表明,血红蛋白浓度在6.0 g/l以下时用钒酸氧化法测定tbil和dbil均无显著性干扰(p0.05);血红蛋白浓度在2.0 g/l以上(25号标本)时用重氮法测定tbil

10、和dbil均有极显著干扰(p 2.5.2 脂血:按上述溶血干扰试验方法,取一份重度脂血标本(三酰甘油浓度为8.0 mmol/l)用两种方法进行脂血干扰试验,结果表明,当三酰甘油浓度为8.0 mmol/l以下时用钒酸氧化法测定tbil和dbil均无显著性干扰(p0.05);但8.0 mmol/l的三酰甘油浓度用重氮法测定tbil和dbil时,均有显著干扰(p 3 讨论 血清总胆红素和直接胆红素的定量测定对诊断黄疸及判断黄疸程度和鉴别黄疸类型有非常重要的意义。选择精密度好、准确度和特异性高、使用方便和速度快的胆红素测定方法,具有临床实用意义。 从本文试验结果可以看出,虽然钒酸氧化法和重氮法测定血清

11、总(直接)胆红素的批内和日间不精密度均达到美国clia88的规定(批内cv 钒酸氧化法采用液体双试剂直接上机使用,克服了重氮法单一试剂受血清本底的干扰和试剂不稳定的不足,有效地避免了溶血及脂血标本对试验的干扰6。 综上所述,从整体来看,钒酸氧化法在精密度、线性范围、准确度、方法比较、稳定性和抗干扰等方面均较理想,且其试剂价格低廉,存储要求低(室温即可),使用方便,能适应各种全自动生化分析仪的使用,是一种值得推广的,适用于血清总胆红素和直接胆红素日常测定的方法。 参考文献 1amin sb. clinical assessment of bilirubin induced neurotoxici

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