胃癌组织中DNA聚合酶β基因突变特点分析

1、胃癌组织中dna聚合酶基因突变特点分析 作者：赵洁，董子明，毛海洲，王煊，赵国强 【关键词】 ,dna聚合酶 mutation characteristics of dna polymerase beta gene in human gastric carcinoma tissue 【abstract】 aim: to detect the mutation characteristics of dna polymerase beta gene (pol gene) in human gastric carcinoma. methods: total rna was extracted fro

2、m 32 gastric cancer samples and 32 tissue samples adjacent to tumors. the rtpcr was carried out and the pcr product was cloned and sequenced with sangers method subsequently. results: three from the seven abnormal sscp samples were sequenced and the mutation sites were: site 196 ag, site 268 ag and

3、site 790 at. no mutation was found by sequencing in a normal pcrsscp sample of the tissues adjacent to the tumor. omiga analysis showed that the three point mutations led to changes of amino acid: site 196 ag of nucleic acid resulted in site 28 asnser of amino acid, site 268 ag of nucleic acid resul

4、ted in site 52 lysarg of amino acid, and site 790 at of nucleic acid resulted in site 226 aspval of amino acid. choufasman method of dnasis showed that site 196 ag mutation caused great changes in the secondary structure of polenzyme. conclusion: the polgene mutation rate is up to 21.9%. the three p

5、oint mutations observed in this study all lead to the alternation of amino acid. site 196 ag mutation can cause great changes in the secondary structure of pol enzyme. 【keywords】 dna polymerase beta; gene mutation; stomach neoplasms 【摘要】 目的：探讨人胃癌dna聚合酶(pol)基因突变的特点. 方法：对32例人胃癌组织及32例正常对照组织中提取总rna，进行rt

6、pcr，sscp，对pcr产物克隆后以sangers法测序，并采用omiga及dansis软件分析结果. 结果：人胃癌标本的pol基因突变率21.9%. 测序分析了7例sscp异常中的3例，其突变分别为196位ag，268位ag，790位at；经omiga软件分析，这3个pol的点突变均导致了氨基酸的改变，具体形式为：核酸196位ag导致氨基酸28位asnser；核酸268位ag导致氨基酸52位lysarg；核酸790位at导致氨基酸226位aspval. dnasis软件choufasman算法推测，pol的196位ag突变可以导致pol酶蛋白的二级结构图明显改变. 结论：人胃癌组织pol基

7、因突变率达21.9%；这3个pol的点突变都导致了氨基酸的改变，196位ag突变可以导致pol酶蛋白的二级结构明显改变. 【关键词】 dna聚合酶；基因突变；胃肿瘤 0引言 dna 聚合酶(pol)为真核生物中5种dna聚合酶之一,是一重要的碱基切除修复(ber)酶,有利于维持基因组的稳定性. 有关dna修复酶基因的表达及突变和遗传性微卫星不稳定性及与基因突变途径的关系已为肿瘤分子机制的深入研究提供了一个新领域1-3. 我们研究人胃癌组织中pol基因突变位点及对应氨基酸、蛋白质二级结构的改变，探讨其在胃癌发生中的作用. 1材料和方法 1.1材料 胃癌及癌旁组织标本32例，取自济南军区第155中

8、心医院、郑州大学第一医院、河南省人民医院胃镜室，经病理检查确诊为胃癌. 每份标本取自癌组织和癌旁正常组织各3块,标本离体后迅速置于-196液氮保存. 1.2方法 应用qiagen公司总rna提取试剂盒提取总rna,amv 42反转录合成cdna；用pol sscp引物进行pcr扩增，扩增出pol的7个基因片段；将pcr扩增产物进行sscp分析，筛选出突变基因序列；以全基因引物扩增在sscp中被发现的异常标本的pol基因完整dna序列；选择pgemt为载体，用t4 dna连接酶连接目的基因pol和质粒dna；选用e.coli jm109为宿主菌，用氯化钙共沉淀法制备感受态细胞并将重组体转入宿主菌

9、. 在用插入灭活法和蓝白筛选下得到阳性克隆（pgemtpol）；使用t7/sp6引物扩增方法鉴定重组体；提取重组质粒（pgemtpol）进行dna序列测定；得到序列用dnasis，omiga软件与genbank中查到的dna聚合酶基因序列进行同源性比较分析，推测其蛋白序列并分析蛋白同源性及结构改变情况. 2结果 在32例胃癌组织标本中有7例sscp异常，突变率为21.9%. 而对应的32例癌旁组织pcrsscp结果中未见异常. 对7例sscp异常中的3例进行dna测序,与genbank中查到的pol基因进行同源比较和分析,结果发现,pol基因的第790位由a变为t,突变类型为颠换 ,第268位

10、由a变为g，突变形式为转换，第196位由a变为g，突变形式为转换. 经omiga软件分析，推测pol各变异位点对应的氨基酸的变异情况(tab 1). 应用asis软件choufasman算法推测pol氨基酸序列二级结构结果(fig 1).表1pol各变异位点对应的氨基酸变异情况（略） 3讨论 细胞dna损伤与肿瘤的发生有密切关系. pol是一重要的dna修复酶,其突变与一些肿瘤的发生有关. 在结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌和食管癌等中检测到的pol基因突变4-7和本实验中检测到胃癌的pol基因突变的形式和部位均不相同，突变率也有差异. 本组32例癌组织标本中突变率为21.9%，突变形式仅有点突变一

11、种，不存在pol基因缺失的现象. 推断：pol突变率，结直肠癌食管癌胃癌. 在胃癌中pol突变的研究中发现，178位tc（22leupro）,828位tc（239cysarg）,229位ag（39tyrcys）,591位ga（160aspasn）,993位ag（294asnasp）,996位ga（295glulys）等点突变，并且指出996位ga是胃癌中pol突变的相对热点. 我们发现的pol的突变位点与日本学者iwanaga等8不同，从我们的结果似乎不支持996位ga是胃癌中pol突变的相对热点. 【参考文献】 1 li b，lee my. transcriptional regulatio

12、n of the human dna polymerase catalytic subunit gene pold1 by p53 tumor suppressor and sp1 j. biol chem, 2001;276(8):29729-29739. 2 白飞虎，郭新宁，杨力,等. 人胃癌裸鼠胃原位移植转移模型的建立j. 第四军医大学学报，2003；24(10): 873-875. bai fh, guo xn, yang l, et al. establishment of transplantation of in situ human gastric tumor metastas

13、is model in nude micej. j fourth mil med univ,2003;24(10):873-875. 3 蔡永国，房殿春，杨仕明，等. 胃癌组织中肝素酶mrna的表达意义j. 第四军医大学学报,2004;25(10):909-911. cai yg, fang dc, yang sm ,et al. significance of heparanase mrna expression in gastric carcinoma tissuesj. j fourth mil med univ,2004;25(10):909-911. 4 dobashi y, shu

14、in t, tsuruga h, et al. dna polymerase beta gene mutation in human prostate cancer j. cancer res, 1994;54(11):2827-2829. 5 matsuzuaki j, dobashi y, miyamoto h, et al. dna polymerase beta gene mutation in human bladder cancer j. mol carcinog,1996;15(1):38-43. 6 董子明, 赵国强,赵勤,等. 人食管癌中聚合酶基因突变的研究j. 中华医学杂志,2002;82(13):899-902. dong zm, zhao gq, zhao q, et al. a study of dna polymerase mutation in human esophageal cancerj. natl med j china,2002;82(13):899-902. 7 wang l, patel u, ghosh l, et al. dna polymerase mutation in human colorectal cancer j. ca