二氯化钴在体外细胞缺氧研究中的应用

1、国际口腔医学杂志第36卷第4期2009年7月internationaljournalofstomatologyvol.36no.4jul.2009收稿日期2008-11-20修回日期2009-03-23作者简介权晶晶1983男安徽人硕士通讯作者凌均棨te氯化钴是一种化学制剂在体外诱导细胞缺氧研究中常用结晶水形态六水合氯化钴。本文将就二氯化钴体外模拟细胞低氧环境的机制及二氯化钴在细胞增殖、分化及应激反应研究中的应用作一综述。1二氯化钴体外诱导细胞缺氧的机制二氯化钴应用于体外模拟细胞低氧环境这与二价钴离子可诱导细胞中低氧诱导因子hypoxiainducedfactorh

2、if及其调控基因的表达有关。转录因子hif由和两个亚基组成其中亚基是功能性亚基包括3种同分异构体hif-1、hif-2、hif-3通常有氧条件下在胞质内处于失活状态亚基是结构性亚基因非依赖性氧降解在胞核内稳定表达1。hif-蛋白有近200氨基酸序列被称作氧依赖性降解区域oxygendepen-dentdegradationdomainodd常氧下odd中一些脯氨酸残基被脯氨酸羟化酶prolylhydroxy-lasesphd羟化随后经抑癌基因vonhippel-lindau产物vonhippel-lindauproteinpvhl特异性识别并通过泛素化途径降解2。由于二价钴离子可通过置换phd

3、辅助因子二价铁离子阻止hif-被羟基化同时能影响pvhl结合hif-odd因此二氯化钴可稳定细胞内hif-的表达3。低氧累积的hif-与胞核中一直持续表达的hif-形成异源二聚体hif识别并结合调控基因中的低氧反应元件hypoxiaresponseelementhre激活靶基因的转录。hre目前已知存在于高达100余种基因的dna序列中涉及能量代谢、红细胞生成、血管收缩与发生、细胞增殖与分化、铁与血红素的代谢以及一些细胞因子和no的合成等多方面4-5。2二氯化钴在细胞增殖、分化及应激反应研究中的应用2.1应用于体外神经细胞相关研究nowak等6用含浓度为100mol/l的二氯化钴无血清培养基体

4、外诱导新生鼠神经元及神经胶质细胞缺氧24h后发现垂体腺苷酸环化酶促多肽pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptidpacap及血管活性肠肽vasoactiveintestinalpep-tidevip激活的腺苷酸环化酶受体激活的环磷酸腺苷cyclicadenosinemonophosphatecamp表达量与正常氧组细胞相比明显下降。实验提示低氧可通过干扰受体蛋白或其耦联水平来影响pacap和vip的表达减弱对神经系统保护的作用。二氯化钴在体外细胞缺氧研究中的应用摘要二氯化钴常用于体外诱导细胞缺氧在细胞增殖、分化及应激反应研究中得到广泛应用。牙髓

5、炎症状态时存在低氧环境有关二氯化钴的应用研究为体外诱导牙髓细胞缺氧提供了可借鉴的思路和方法。关键词二氯化钴细胞低氧低氧诱导因子中图分类号r318.08文献标识码aapplicationofcobaltchlorideincellhypoxiainvitroresearchquanjing-jingligun-qi.researchinstituteofstomatologyguanghuaschoolofstomatologysunyat-senuniversityuangzhou510080chinaabstractcobaltchlorideahypoxia-mimickingagenti

6、swidelyusedintheresearchofcellproliferationdif-ferentiationandvarioushypoxicresponses.thepulpalinflammationcouldresultinhypoxiaandsubsequentpulpdamageandthesestudiesoncobaltchloridemayprovidenewmethodstoinducedentalpulpcellshypoxiainvitro.keywordscobaltchloridehypoxiahypoxiainducedfactor权晶晶综述凌均审校中山大

7、学光华口腔医学院口腔医学研究所广东广州510080棨455-国际口腔医学杂志第36卷第4期2009年7月internationaljournalofstomatologyvol.36no.4jul.2009wang等7用150nmol/l二氯化钴培养液处理n9鼠类小神经胶质细胞株16h后电泳迁移率变动分析electrophoreticmobilityshiftassayemsa显示hif-1dna表达量明显上调同时细胞趋化因子受体cxcr4mrna及蛋白表达量与对照组相比增加具有统计学意义。体外迁移实验还证实相对于对照组处理组细胞对质量浓度为200mgl的趋化因子基质细胞衍生因子-1strom

8、alcell-derivedfactor-1sdf-1的反应率显著增加。实验表明低氧-hif-1-cxcr4通路调控神经胶质细胞向神经系统低氧受损处的迁移。zhang等8研究发现鼠与人的炎症细胞因子白细胞介素interleukinil-1dna启动子序列中存在hif-1的结合区域。当用125moll二氯化钴无血清培养液处理人神经胶质细胞4h后逆转录聚合酶链反应reversetranscription-polyme-rasechainreactionrt-pcr及westernblotting表明hif-1mrna及蛋白表达量均上调同时4h及24h酶联免疫吸附测定enzyme-linkedim-

9、munosorbentassayelisa显示处理组细胞il-1分泌表达量与对照组相比分别增加约3倍和5倍。当hif-1基因敲除小鼠神经胶质细胞经同样浓度二氯化钴处理后il-1表达量相对于正常小鼠降低进一步证实hif-1参与调控il-1的转录和表达。他们随后用125moll二氯化钴培养液分别处理人与鼠神经胶质细胞4h及6h后发现hif-1以类似的机制调控人单核细胞趋化因子-1monocytechemoattractantprotein-1mcp-1及mcp-5的转录与表达9。2.2应用于体外癌细胞相关研究guo等10用100moll二氯化钴培养液处理h441人肺腺癌细胞株48h后发现甲状腺转录

10、因子-1thyroidtranscriptionfactor-1ttf-1蛋白表达量降低多形性腺癌类基因-2产物pleo-morphicadenomagenelike-2plagl-2表达恒定。同时细胞表面疏水蛋白surfactantproteinsp-b启动子活动降低而sp-c启动子活动增加。随后处理组细胞染色质染色证实相对于正常组细胞plagl-2蛋白多密集分布于细胞核内通过结合sp-c启动子序列调控sp-c蛋白的表达维持低氧时肺泡细胞的表面张力。wilson等11将mcf-7人乳腺癌细胞株培养在含50moll二氯化钴培养液24h后发现与对照组相比处理组细胞趋化因子受体ccr7mrna表达

11、量上调。同时质粒转染实验显示携带hif-1抑制活性质粒的mcf-7细胞经内皮素-1endothelin-1et-1刺激后ccr7mrna表达量明显减少。实验结果表明et-1通过结合其受体调控癌细胞ccr7的表达需转录因子hif-1的参与。et-1及ccr7与乳腺癌细胞远距离淋巴结转移有关该实验提示可将et-1及ccr7作为侵袭性乳腺癌的治疗靶点。hayashi等12研究低氧环境中滋养层来源细胞是否表达葡萄糖载体-1glucosetransporter-1glut-1当250moll二氯化钴培养液处理bewo人绒毛膜癌细胞株与rcho-1鼠绒毛膜癌细胞株18h后与正常氧浓度组相比bewo细胞gl

12、ut-1mrna及蛋白表达量分别增加2.2倍与2.7倍类似的结果在rcho-1细胞同样可以观察到。质粒转染实验还表明glut-1基因启动子序列中存在hif-1的结合区域glut-1表达上调有助于抵消低氧时能量不足对细胞的损伤。huang等13用不同浓度二氯化钴培养液处理nb4人急性早幼粒细胞性白血病acutepromyelo-cyticleukemiaapl细胞株发现200moll培养3d后诱导细胞凋亡而浓度为12.550.0moll的培养液抑制细胞增殖但不影响细胞活力。非毒性浓度如25moll和50moll可诱导nb4细胞分化细胞形态发生改变如染色质紧缩、细胞核变小细胞分化相关抗原cd11b

13、、cd11c表达量增加。50moll二氯化钴明显上调nb4细胞hif-1蛋白的表达同时emsa分析表明培养48h后细胞核dna序列中低氧反应元件活动增加。这些实验结果提示可将细胞低氧制剂作为急性髓细胞样白血病acutemyeloidleukemiaaml“分化治疗”用药的选择。2.3应用于体外血管内皮及平滑肌细胞相关研究yamaji等14用二氯化钴浓度为100moll培养液处理mbec4鼠脑毛细血管内皮细胞株12h后发现处理组与低氧组氧体积分数为2均可上调磷酸丙糖异构酶triosephosphateisomerasetpimrna与蛋白的表达。tpi是一种相对分子质量为27000的应激反应蛋白

14、具有部分糖酵解酶活性对延长细胞低氧条件下的存活时间起辅助作用。实验还证实mbec4细胞tpi的过表达与转录因子ap-1元件及hif-1的共同调控有关。2003年cioffi等15研究低氧状态下人血管内皮及平滑肌细胞脯氨酸羟化酶的表达情况当456-国际口腔医学杂志第36卷第4期2009年7月internationaljournalofstomatologyvol.36no.4jul.2009500mol/l二氯化钴培养液处理人冠状动脉平滑肌细胞与主动脉内皮细胞4h后实时荧光定量聚合酶链反应real-time-polymerasechainreactionrt-pcr结果显示phd-3mrna的表

15、达量上调phd-2、phd-3mrna增加不明显。westernblot-ting分析表明二氯化钴诱导hif-1蛋白表达增加且与phd-3mrna上调有一致性。质粒转染实验还发现phd-3过表达有效抑制hif-1蛋白结合phd在常氧下通过羟基化作用降解hif-1提示可通过调控phd-3提高患病心肌层的存活与治愈率。corley等16用二氯化钴培养液处理牛冠状动脉平滑肌细胞与牛主动脉平滑肌细胞后发现1d与5d细胞核提取总蛋白westernblotting分析有hif-1表达处理组细胞增殖曲线与细胞分化特定基因的表达与对照组相比没有统计学差异。24h细胞划痕实验显示处理组细胞迁移能力下降。此外相对

16、于正常氧组低氧导致两种平滑肌细胞对胶原酶、弹力蛋白、层粘连蛋白、纤维结合蛋白的黏附能力分别下降27与38。实验进一步证实hif-1通过抑制黏着斑激酶的磷酸化作用而影响细胞的黏附及迁移能力。kim等17研究低氧是否诱导人肺微血管内皮细胞humanpulmonarymicrovascularendothelialcellhpmvec与人真皮微血管内皮细胞humandermalmicrovascularendothelialcellhdmvec炎症趋化因子的表达发现当1mm/l二氯化钴无血清培养液处理hpmvec60min后趋化因子mcp-1mrna表达量增加2倍240min后il-8mrna表达增

17、加数倍。实验还发现il-8的上调需激活pi-3k及p38mapk信号通路。当hdmvec转染hif-1sirna质粒后二氯化钴处理组比对照组il-8表达量下降60转染phd-2sirna质粒后二氯化钴诱导il-8表达量表增加23倍。同时dna序列分析表明il-8启动子-83至-80序列是hif-1的结合区域因此hif-1调控低氧状态下两种血管内皮细胞il-8的表达。3牙髓细胞低氧相关研究牙髓组织具有高度血管化特征且被硬组织包绕当受到一定刺激时血管扩张和通透性增加、组织压上升18从而导致血流减少和局部低氧。牙髓感染时炎性介质的释放19、充填术等修复性治疗措施以及局麻药中的血管收缩剂都可对牙髓细胞

18、产生低氧的压力。此外上颌骨截骨术、牙齿撕脱及牙再植术同样容易造成牙髓组织缺氧20。目前多数学者在模拟低氧环境体外培养牙髓细胞时采用直接调节培养箱内氧体积分数的方法。如amemiya等20将成年beagle犬前磨牙牙髓细胞在氧体积分数为5培养时发现细胞活力与对照组氧体积分数为20相比没有明显改变均为92而细胞增殖率增加。rt-pcr及westernblotting分析显示低氧组细胞有hif-1表达当缺氧牙髓细胞恢复氧供24d后热休克蛋白70heatshockprotein70hsp70的表达增加约1.4倍。hsp70是一种分子伴侣蛋白可维持细胞内环境的稳定多在低氧细胞及缺血组织中表达。该实验结果

19、提示hsp70在牙髓细胞抵抗低氧压力及维持细胞活力中起重要作用。ueno等21将鼠单克隆牙髓细胞rpc-c2a置入氧体积分数为1.0的培养箱培养24h后发现与正常氧体积分数组20相比细胞增殖受到抑制。48h细胞周期分析表明低氧组g1期细胞数从开始的51.3增加至71.6而s期、g2/m期细胞量从48.5减少为17.6。此外免疫印迹实验证实低氧导致细胞周期相关蛋白如p21与cyclind2表达降低抑制牙髓细胞视网膜母细胞瘤蛋白retinoblastomaproteinrb磷酸化导致非磷酸化rb过表达影响rpc-c2a细胞无法进入细胞周期s期。fukuyama等22研究发现2氧体积分数培养rpc-

20、c2a牙髓细胞6h后细胞增殖率与正常氧体积分数组20相比没有明显区别westernblotting分析显示细胞细胞磷酸腺苷激酶adenosinemonophosphateactivatedproteinkinaseampk1、1、1亚单位蛋白表达增加2至4倍hif-1增加约5倍。当用小分子rna抑制ampk1表达72h之后低氧组与正常组细胞增殖分别下降39与35而hif-1不依赖于ampk1在低氧ampk1sirna组与对照组均有表达。ampk作为细胞内部能量的感受器之一与维持多种细胞缺氧时的能量代谢有关。ampk在低氧rpc-c2a牙髓细胞的表达有助于寻找新的药物进行活髓保存治疗。4参考文献

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25、ntres2007869903907.本文编辑骆筱秋上接第454页200716117.7rollnickbrkayeci.amjmedgenet1983152233253.8beckaehudginslhoymehe.amjmedgeneta20051344359362.9richiericostaaribeirola.cleftpalatecraniofacj2006434429434.10connorjmfernandezc.humgenet1984684349.11ryancafinernnivese.amjmedgenet1988294755761.12callierpfaivrelthauvinrobinetce