酶免疫技术课件

1、酶免疫技术第八章酶免疫技术酶免疫技术教学目的要求：1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原；熟练掌握固相载体。2.熟练掌握酶免疫技术的分类3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理4.掌握酶免疫测定的应用酶免疫技术放射免疫技术放射免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术三大经典标记技术酶免疫技术酶免疫技术基本原理基本原理抗原抗体反应抗原抗体反应的特异性的特异性+酶高效催化反酶高效催化反应的专一性应的专一性 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 第一节第一节 酶免疫技术的特点酶

2、免疫技术的特点酶免疫技术基本原理基本原理 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 第一节第一节 酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点底物底物 E酶标抗体酶标抗体EE抗原抗原酶免疫技术一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物 （一）标记酶的要求：（一）标记酶的要求： 活性高，纯度高活性高，纯度高作用专一性强作用专一性强性质稳定，易与抗原或抗体偶联性质稳定，易与抗原或抗体偶联测定方法简便易行、敏感、精确测定方法简便易行、敏感、精确酶和底物对人体无害酶和底物对人体无害酶和底物价廉易得酶和底物价廉易得酶免疫技术辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（

3、HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm （辅基）（辅基）与与275nm275nm（主酶）（主酶）ODOD值之值之比比 纯度数（纯度数（RZRZ）值与）值与酶活性无关，酶活酶活性无关，酶活性单位（性单位（U U）比）比RZRZ值值更为重要更为重要 酶的纯度并不代表酶的纯度并不代表酶的活力酶的活力 国内以辣根过氧化酶最为常用国内以辣根过氧化酶最为常用1 1、辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase ,HRP） （

4、一）常用的酶（一）常用的酶酶免疫技术DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O 供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有多种习惯上被称为底物，底物有多种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体的专一性很高对受氢体的专一性很高 HRPHRP催化的反应式为：催化的反应式为：HRPHRP酶免疫技术邻苯二胺邻苯二胺 OPD反应后显反应后显橙黄色橙黄色，加酸终止反应，加酸终止反应后呈后呈棕黄色棕黄色，测定波长，测定波长492492nm。不稳定，有致。不稳定，有致癌性。癌性。四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMB反应后显反应后显蓝色蓝色 ，加酸终

5、止，加酸终止反应后变为反应后变为, ,测定波长测定波长450450nm ，稳定，无致，稳定，无致癌性，癌性，ELISA中应用最广泛的底物。中应用最广泛的底物。 HRP常用底物常用底物酶免疫技术（二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP) 是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取 AP的的 底物底物 对对- -硝基苯磷酸硝基苯磷酸酯（酯（ pNPP ）经经APAP作用后的产物为黄色对作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为硝基酚，最大吸收峰波长为405 405 nm。 敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、稳定性差，价格

6、贵酶免疫技术（三）（三）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（-galactosidase，-Gal） 源于大肠埃希菌源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。，常用于均相酶免疫测定。 -Gal的底物的底物 4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基- -D半乳糖苷半乳糖苷（ 4MUG ）酶作用后，生成高强度荧酶作用后，生成高强度荧光物光物 ，用荧光计测量。，用荧光计测量。酶免疫技术二、酶标记抗体或抗原二、酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶结合物酶标记物酶标记物 通过化学反应或免通过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 酶免疫技术

7、（一）酶标记抗体或抗原的制备（一）酶标记抗体或抗原的制备标记方法要求标记方法要求技术方法简单、产率高，重复性技术方法简单、产率高，重复性好好标记反应不影响酶和抗原或抗体标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性的活性酶标记物稳定酶标记物稳定 ，不易发生解离，不易发生解离酶免疫技术制备方法制备方法2.2.过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法常用于常用于HRPHRP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 1.1.戊二醛交联法戊二醛交联法适合各种酶蛋白的标记。适合各种酶蛋白的标记。酶免疫技术（二）酶标记物的纯化与鉴定（二）酶标记物的纯化与鉴定 1 1酶标记物的纯化酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游标记完成

8、后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体离抗体( (抗原抗原) )、酶聚合物及抗体、酶聚合物及抗体( (抗原抗原) )聚合物，聚合物，避免避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体游离酶增加非特异显色以及游离抗体( (抗原抗原) )的竞争作用。的竞争作用。 常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。硫酸铵沉淀法等。酶免疫技术 2.2.酶标记物的鉴定酶标记物的鉴定（1 1）免疫活性鉴定：免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体( (抗原抗原) )具有具有免疫活性。免疫

9、活性。 （2 2）酶标记率测定：酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体物中酶和抗体( (抗原抗原) )蛋白的含量，然后按公式计算蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。其标记率。 酶免疫技术三、固相载体三、固相载体 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法用方法 固相抗体或抗原固相抗体或抗原: :就是把抗体或抗原结就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面合到固相载体的表面 酶免疫技术（一）固相载体的要求（一）固相载体的要求结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大

10、 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济酶免疫技术（二）固相载体的种类（二）固相载体的种类1 1塑料制品塑料制品 由聚苯由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。乙烯、聚氯乙烯制成。形状。主要有微量反应形状。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。板、小试管和小珠三种。 2 2微颗粒微颗粒 微颗粒是由微颗粒是由高分子单体聚合成的微高分子单体聚合成的微球或颗粒。球或颗粒。 3.3.微孔虑膜微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（维素

11、膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。 微量反应板微量反应板酶免疫技术酶免疫技术（三）包被与封闭（三）包被与封闭将抗原或抗体固相化结合在固相载体将抗原或抗体固相化结合在固相载体上的过程称为上的过程称为包被包被（coating)coating)。酶免疫技术以聚笨乙烯固相载体（如制以聚笨乙烯固相载体（如制ELISAELISA板）板）为为例说明免疫吸附的过程：例说明免疫吸附的过程：抗原（抗体）抗原（抗体）用用PH9.6PH9.6的碳酸盐溶的碳酸盐溶液稀释液稀释 4 4C C过夜过夜用用10%10%的小的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表牛血清再包被一次，以消除固相载体表面

12、未吸附的位点，此过程叫做面未吸附的位点，此过程叫做封闭封闭。酶免疫技术24第二节第二节 酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类克隆酶供体免疫测定克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定均相酶免疫测定异相酶免疫测定异相酶免疫测定酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定：固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)组织切片或其它标本中抗原的定位分析组织切片或其它标本中抗原的定位分析 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量酶免疫技术一、均相酶

13、免疫测定法一、均相酶免疫测定法 酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物酶标记物。 未未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离游离标记物。标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合结合标记物。标记物。Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）酶免疫技术一、均相酶免疫测定法一、均相酶免疫测定法 基本原理基本原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。后，其中的酶活性将发生改变。 因此，不需对反应

14、液中因此，不需对反应液中结合和游离结合和游离的酶标记的酶标记物进行分离，物进行分离，直接测定直接测定反应系统中反应系统中总酶活性的变总酶活性的变化化即可推算出被测样品中抗原的含量。即可推算出被测样品中抗原的含量。Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）酶免疫技术二、异相液相酶免疫测定法二、异相液相酶免疫测定法基本原理基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离方法分离游离的游离的和和结合的酶标记物结合的酶标记物，然后对经酶，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（

15、或抗体）的含量。依据测定方法又可分中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分为为液相液相和和固相酶免疫测定固相酶免疫测定。目前临床上多用固相。目前临床上多用固相酶免疫测定法。酶免疫测定法。Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）酶免疫技术第三节第三节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）一、基本原理一、基本原理底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析包被包被将已知抗原或抗将已知抗原或抗体吸附在固相载体吸附在固相载体表面体表面反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复

16、合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234酶免疫技术二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理（一）检测抗原的方法（一）检测抗原的方法 将将己知抗体己知抗体包被固相载体，待检标本中的相包被固相载体，待检标本中的相应应抗原抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体固相抗体- -抗原抗原- -酶标抗体复合物，根据加底物后酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。的显色程度确定待检抗原的含量。 1.双抗体夹心法双抗体夹心法酶免疫技术 E固相抗体

17、固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体EE底物底物双抗体夹心法检测抗原双抗体夹心法检测抗原 适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原酶免疫技术（1 1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2 2）加待检标本）加待检标本, ,温育，洗涤。温育，洗涤。 （3 3）加酶标抗体，洗涤。）加酶标抗体，洗涤。（4 4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。定性或定量。 2 2技术要点技术要点 E固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体EE底底物物酶免疫技术（+ +）1、已知抗

18、体包3、加酶标抗体 4、加酶作用的2、加待检抗原4、加酶作用的洗涤洗涤洗涤洗涤1、已知抗体包2、加待检物3、加酶标抗体 （- -）Y YY YY YY YY YY YE EY YE EY YE EY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YE EY YE EY YE EY YY YY YY YY YY YY YE EY YE EY YE EY YY YY YY Y洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原酶免疫技术2.双位点一步法检测抗原双位点一步法检测抗原 即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上上两个不同表位两个不同表位的单克隆抗体，

19、分别作为固相抗的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。 酶免疫技术 EEE底物底物固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体双位点一步法检测抗原双位点一步法检测抗原 在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗酶免疫技术3.加酶作用的底物2.加待检抗原洗涤1.已知抗体包Y YY YY YY YE EY YY YE EY YY YY YE EY YY

20、YE EY YY Y（+ +）3.加酶作用的底物2.加待检物（无抗洗涤1.已知抗体包Y YY YY YY YE EY YY YE EY YY Y（- -）Y YY YY Y洗涤洗涤双位点一步法测抗原双位点一步法测抗原酶免疫技术 如果待检标本中抗原浓度过高，如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成容易形成“钩状效应钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。稀释后重新测定。注意事项注意事项 EE底物底物固相抗体固相抗体标本（抗原浓度高）标本（抗原浓度高）酶标抗体酶标抗体E酶免疫

21、技术3.竞争法检测抗原竞争法检测抗原 酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈待检抗原含量呈反比反比。待检抗原量越多，酶标抗。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。量呈反比。 酶免疫技术酶标抗原酶标抗原 EEEE固相抗体

22、固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）底物底物E竞争法检测抗原竞争法检测抗原酶免疫技术（1 1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2 2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3 3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色）加底物显色。对照管中颜色深

23、，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。越淡，表示标本中抗原含量越多。技术要点技术要点酶免疫技术3.加酶作用的底物2.加待检抗原洗涤1.已知抗体包Y YY YY YY Y Y YY Y（+ +）E EY Y Y YY YE E3.加酶作用的底物2.加待检物（无抗洗涤1.已知抗体包Y YY YY YY Y Y YY Y（- -）E EY Y Y YY YE EE EE EE EE EE EE E洗涤洗涤竞争法测抗原竞争法测抗原酶免疫技术（二）检测抗体的方法（二）检测抗体的方法 将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原相应抗体与之

24、结合，形成固相抗原- -抗体复合物，抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原形成固相抗原- -抗体抗体- -酶标二抗复合物，根据加底酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。物后的显色程度确定待检抗体含量。 1.间接法间接法酶免疫技术 固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标二抗酶标二抗底物底物EEE间接法检测抗体间接法检测抗体酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG），因此该法只需要变换固相抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性酶免疫技术4.加酶作用的底物2.加待检抗体洗涤1

25、.已知抗原包（+ +）Y YY YY Y3.加酶标二抗洗涤Y YY YY YY YE EY YE EY YE EY YY YY YY YE EY YE EY YE E4.加酶作用的底物2.加待检物 （无抗体）洗涤1.已知抗原包（- -）3.加酶标二抗洗涤Y YE EY YE EY YE E洗涤洗涤间接法测抗体间接法测抗体酶免疫技术2.2.双抗原夹心法双抗原夹心法 将已知抗原包被固相载体，待检标本中的将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原结合，形成固相抗原- -抗体抗体- -酶标抗原复合物，酶标抗原复

26、合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。同双抗体夹心法。同双抗体夹心法。技术要点技术要点酶免疫技术E固相抗体固相抗体标本（含抗体）标本（含抗体）酶标抗原酶标抗原底物底物EE双抗原夹心法检测抗体双抗原夹心法检测抗体酶免疫技术4.加酶作用的底物（+ +）（- -）4.加酶作用的底物2.加待检抗体洗涤1.已知抗原包3.加酶标抗原洗涤Y YE EY YY YY YY YE EY YE EY YE EY YE EY YE E2.加待检物 （无抗体）洗涤1.已知抗原包3.加酶标抗原洗涤E EE EE E洗涤洗涤双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体酶免疫技术3.

27、竞争法检测抗体竞争法检测抗体同竞争法结合抗原。同竞争法结合抗原。HBcAb和和HBeAb的测定均采用竞争法，但其的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。测定具体模式有区别。1 1原理原理酶免疫技术（1 1）竞争法检测）竞争法检测HBcAb：将将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。量成反比。2 2技术要点技术要点

28、酶免疫技术固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE竞争法检测竞争法检测HBcAbHBcAb酶免疫技术3.加酶作用的底物3.加酶作用的底物2.加待检抗体 和酶标抗体洗涤1.已知HBcAg包（+ +）Y YY YY YE EY YY YY YE E2.加待检物（无抗体）和酶标抗体洗涤1.已知HBcAg包（- -）Y YY YY YE EY YY YY YE EE EE EE EE EY YE E洗涤洗涤竞争法检测竞争法检测HBcAbHBcAb酶免疫技术（2 2）竞争法检测）竞争法检测HBeAb：将将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和加入待检标本和HBe

29、Ag，温育，洗涤。，温育，洗涤。加入酶标加入酶标HBeAb，温育，洗涤。，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。体含量成反比。酶免疫技术固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体底物EEE竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb酶免疫技术（+）（- -）4.加酶作用的底物2.加待检抗体 和HBeAg洗涤1.已知HBeAb包Y YY Y Y YY YY Y Y YY YY YY YY Y Y YY YY Y3.加酶标HBeAb洗涤Y YE EY YE EY YY

30、 Y Y YY YY YY YE E4.加酶作用的底物2.加待检物（无抗体）和HBeAg洗涤1.已知HBeAb包Y YY Y Y YY YY Y Y YY YY Y Y Y3.加酶标HBeAb洗涤Y YE EY YE EY YY Y Y YY YE EY YE EY YE EY YE E洗涤洗涤竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb酶免疫技术4.捕获法捕获法 将抗人将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检抗体吸附于固相载体上，待检标本中的标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入类抗体多被固相抗体捕获。加入特异抗原与固相抗体捕获的特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，类抗体结合，再加入抗原

31、特异的酶标抗体，形成固相抗人再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人IgM-IgM-抗原抗原- -酶标抗体复合物。最后根据加酶标抗体复合物。最后根据加底物后的显色程度确定待检底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。抗体的含量。 酶免疫技术固相抗人固相抗人lgMlgM抗体抗体E标本（含抗标本（含抗体）体）抗原抗原底物底物EEE固相捕获法检测固相捕获法检测lgMlgM抗体抗体酶免疫技术5.加酶作用的底物5.加酶作用的底物2.加待检抗体（IgM） 洗涤1.已知抗人IgMY Y Y Y Y YY Y Y Y Y YY YY YY Y Y Y Y YY Y4.加酶标抗体洗涤E EY YE E3.加入特异

32、性抗原洗涤Y Y Y Y Y YY YY YY YY Y Y Y Y YY YE EY YY YY YY YY YY YE EY YY Y2.加待检物 （无特异性IgM） 洗涤1.已知抗人IgMY Y Y Y Y YY Y Y Y Y YY Y Y Y Y YY Y4.加酶标抗体洗涤E EY YE E3.加入特异性抗原洗涤Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YY YY YY YY Y（+）（- -）洗涤洗涤捕获法捕获法酶免疫技术方法评价方法评价ELISA具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、应用范围广泛、无反射性同位实验设备要求

33、简单、应用范围广泛、无反射性同位素污染等优点。素污染等优点。发展最快、应用最广，普及。发展最快、应用最广，普及。 酶免疫技术试剂盒酶免疫技术酶免疫技术（图为瑞士HAMILTON FAME24/20全自动酶免分析仪）酶免疫技术 1病原体及其抗体测定病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊广泛应用于传染病的诊断。断。 2蛋白质测定蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。 3非肽类激素测定非肽类激素测定 如如T3、T4、雌激素、绒毛膜、雌激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状促性腺激素、黄

34、体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素等。腺素等。 4药物和毒品测定药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。霉素、吗啡等。 第四节第四节 酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用酶免疫技术小小 结结 酶免疫分析技术酶免疫分析技术是以酶标记的抗原或抗体作是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的催化作用提高异性反应完成后，通过酶对底物的催化作用提高反应的敏感性。酶免疫分析技术可分为酶免疫组反应的敏感性。酶免疫分析技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类织化学技术和酶免疫测

35、定两大类, ,后者根据抗原后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。而分为均相和非均相两种类型。 酶免疫技术展展 望望 酶免疫技术酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一，是是三大经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单克隆抗体、生物素一亲和素放大系统的应用以及与克隆抗体、生物素一亲和素放大系统的应用以及与化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高了分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程了分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程度，使酶免疫分析技术不断更新，应用范围不断拓度，使酶免疫分析技术不断更新，应用范围不断拓宽。宽。酶免疫技术练 习酶免疫技术 1.用于标记的HRP的RZ值应该大于 A.2.4 B.3.0 C.1.5 D.3.5 E.5.0酶免疫技术 1.用于标记的HRP的RZ值应该大于B A.2.4 B.3.0 C.1.5 D.3.5 E.5.0