原核生物的转录及调控ppt课件

1、原核生物的转录原核生物的转录及其调控及其调控 RNA transcription and regulation in prokaryotes 转录：在转录：在DNA指点的指点的RNA聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以DNA链的一条链为模板，按照碱基配对原那么链的一条链为模板，按照碱基配对原那么合成合成RNA链的过程。链的过程。 不对称转录：在不对称转录：在DNA双链分子中，转录通常只双链分子中，转录通常只在在DNA的一条链上进展，另一条链那么不能转的一条链上进展，另一条链那么不能转录，但能够对转录起调理作用，这种转录方式录，但能够对转录起调理作用，这种转录方式称不对称转录。称不对称转录。 转录单

2、位：就是从启动子到终止子的一段转录单位：就是从启动子到终止子的一段DNA序列。序列。第一节第一节 转录概述转录概述一、基因的编码链和有意义链一、基因的编码链和有意义链 模板链：用于转录模板链：用于转录RNARNA的链称为模板链，或负的链称为模板链，或负链，又称无义链。链，又称无义链。 编码链：与模板链互补的编码链：与模板链互补的DNADNA链称为编码链，链称为编码链，或正链，又称有义链。或正链，又称有义链。二、转录的根本要点二、转录的根本要点 底物：底物：NTP； 模板：反义链；模板：反义链； 方向：方向：53 ； 酶：酶：RNA pol ； 产物：产物：RNA单链单链转录和复制：都是遗传信息

3、的传送转录和复制：都是遗传信息的传送三、转录起始位点三、转录起始位点转录起点位点核苷酸为转录起点位点核苷酸为1 1。上游序列上游序列upstream upstream ：转录起点的前面的序列，：转录起点的前面的序列，用负数码表示，起点前一个核苷酸为用负数码表示，起点前一个核苷酸为1 1。下游序列下游序列downstreamdownstream： 转录起点的后面的序列，转录起点的后面的序列，用正数码表示。用正数码表示。没有编号为的碱基。没有编号为的碱基。第二节第二节 原核生物转录的相关酶类原核生物转录的相关酶类 一、一、E.coli RNA聚合酶聚合酶E.coli只需一种聚合酶；只需一种聚合酶；

4、E.coli RNA pol全酶由全酶由5种亚基组成，即种亚基组成，即2，480kD；2 构成中心酶，中心酶与构成中心酶，中心酶与因子构因子构成全酶。成全酶。 E.coli RNA聚合酶的根本性质聚合酶的根本性质亚亚基基 基基因因 全全酶酶中中的的数数量量 分分子子量量（dalt） 部部位位 可可能能功功能能 rpoA 2 40000*2 多多样样 rpoB 1 155000 结结合合核核苷苷酸酸 rpoC 1 160000 核核心心酶酶 结结合合模模板板 rpoD 1 85000 因因子子 起起始始识识别别因因子子 RNA polymerase in prok. Core EnzymeHol

5、o Enzyme for elongationfor initiation依托静电作用力依托静电作用力依托空间构造依托空间构造非专注性与非特异非专注性与非特异DNA 结结合合专注性与专注性与 特异特异DNA结结合合半衰期；半衰期；60半衰期；数小时半衰期；数小时cover60bp Richard Burgess and Andrew Travers (1969) 150 kD160 kD 70 kD 40 kDCartoon illustrating separation of the subunits of E. coli RNA polymerase by SDS-PAGE1、中心酶：催化

6、磷酸二酯键的构成、中心酶：催化磷酸二酯键的构成 亚基：亚基：2个，功能多样中心酶的组建因子、个，功能多样中心酶的组建因子、促进双链的解开和重新聚合、启动子识别、促促进双链的解开和重新聚合、启动子识别、促进进RNA pol与与DNA 模板链上游转录因子结合模板链上游转录因子结合 亚基：亚基：1个，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯个，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键的构成；键的构成； 亚基：碱性强，与模板链结合；亚基：碱性强，与模板链结合；二、二、RNA聚合酶各亚基的功能聚合酶各亚基的功能2、因子：因子：Reusable；修饰修饰 RNA pol 的构型；的构型；识别启动子，但无催化活性。识别启动子，但

7、无催化活性。 不同原核生物具有根本一样的中心酶，但不同原核生物具有根本一样的中心酶，但亚基亚基有所差别，决议了原核生物基因的选择性表达。有所差别，决议了原核生物基因的选择性表达。3、原核生物、原核生物RNA聚合酶抑制剂：聚合酶抑制剂： 利福平利福平Rifampin：与细菌：与细菌RNA pol 亚基结合，妨碍转录的起始作用；亚基结合，妨碍转录的起始作用； 利链菌素利链菌素 streptolydigin：与细菌：与细菌RNA pol 亚基结合，抑制转录的延伸。亚基结合，抑制转录的延伸。 肝素：与细菌肝素：与细菌RNA pol 亚基结合，妨亚基结合，妨碍其与模板碍其与模板DNA的结合。的结合。第三

8、节第三节 原核生物转录的过程原核生物转录的过程 RNA的转录包括的转录包括promotion，elongation，termination 三过程；三过程； 从从promoter到到terminator称为称为transcriptional unit； 原核生物中的转录单位多为原核生物中的转录单位多为 polycistron ； 转录起始点记为转录起始点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值。，其上游记为负值，下游记为正值。+1 -10 +10upstreamstart pointdownstream一、转录的起始一、转录的起始 关键：全酶能以很高的亲和性结合在启关键：全酶能以很高的亲和性结合

9、在启动子动子promoter ； 启动子：启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始聚合酶识别、结合并起始转录的一段转录的一段DNA序列。序列。promoter 由两个重要部分组成由两个重要部分组成 一原核启动子的构造一原核启动子的构造 -70 -40 ：up element上游元件 CAP-cAMP binding site -35 -10：core promoter中心启动子 RNA pol. binding site 基因表达调控的正控制位点基因表达调控的正控制位点CAP： Catabolite gene Activator ProteincAMP Acceptor ProteincAMP受体

10、蛋白受体蛋白分解代谢基因激活蛋白分解代谢基因激活蛋白 1、中心启动子：、中心启动子： Sextama Box：R siteTTGACSextama Box-35 site。RNA pol. loosely binding sitePribnow Box： TATAATpribnow Box-10 site。RNA pol. firmly binding siteB siteInitiation site ：+1 site。RNA transcriptional startpoint I siteA/G-35 (R)-10 (B)+1 (I)RNAl Sextama Box与Pribnow Bo

11、x间距17bp，有利于RNA pol启动l -35 Box or -10 Box mut. 间距趋近于间距趋近于17 bp，up mutation间距远离于间距远离于17 bp，down mutation17bp的间距比的间距比17bp的序列对转录更为重要的序列对转录更为重要-35 Box and -10 Box mut. 转录效率下降转录效率下降100倍倍 转录效率下降转录效率下降1000倍倍2、上游元件：、上游元件： CAP-cAMP binding site Activator region，AR当：当：ARI + CAP-cAMP AR I：CAP-cAMP 的强结合位点的强结合位点-

12、70 -50 AR II：CAP-cAMP 的弱结合位点的弱结合位点-50 -40cooperative effect提高提高ARII 的结合效率的结合效率IR-70 ARI-40ARII IR -50 RNA pol AR II + CAP-cAMP 复合体：复合体： 促使促使-35 box附近附近GC岛区的双螺旋构造稳定性降低，岛区的双螺旋构造稳定性降低，-10 box的解链温度降低，有利于转录启动的解链温度降低，有利于转录启动 ARI ARII GC Island -35 -10 Null AR II RNA pol. into -10 Box but transcription off

13、 ARII + CAP-cAMPpromotionRNA pol. into -35 Boxinto -10 Boxstarting transcription RNA pol RNA pol-CTDCAP-cAMPARI ARIIARI ARIIActivation transcription Up element + CAP-cAMP RNA Polymerase复合体复合体 CAP-cAMP 与与RNA Polymerase的的-CTD结合，激活转录结合，激活转录 二原核基因转录的起始二原核基因转录的起始 1、因子的作用：因子的作用：降低全酶与普通降低全酶与普通DNA的非专注性结合力的非

14、专注性结合力20000倍；倍；加强全酶与启动子加强全酶与启动子R site、B site的专注性结合的专注性结合力力 100倍；倍；导致导致RNA链的延伸缓慢链的延伸缓慢Promoter与与 factor 间的结合专效性间的结合专效性决议了 strong promoter & weak promoter； -35 box, -10 box的差别影响启动子与RNA pol 中因子的结合才干；不同启动子的-35，-10 box间存在较为保守的规范序列规范启动子； factor is responsible for recognition of consensus sequence of promo

15、ter and only required for initiation.2、RNA pol与启动子的结合与启动子的结合 因子识别启动子上结合位点。因子识别启动子上结合位点。 RNA pol全酶全酶与与-35 box结合结合封锁型启动复合物；封锁型启动复合物； 酶向酶向-10 box挪动，并与之结实结合，促使挪动，并与之结实结合，促使-10 box及起始位点处发生部分解链及起始位点处发生部分解链开放型启动开放型启动复合物；复合物； DNA解螺旋扩展到解螺旋扩展到-10 box下游下游17bp范围。范围。3、转录起始位点的决议、转录起始位点的决议 酶与酶与-10 box 的结合，决议了第一个起始

16、碱基的结合，决议了第一个起始碱基的选择。的选择。 第一个被转录的碱基离第一个被转录的碱基离-10 box 的保守的保守T约约69nts。 mRNA的起始位点多为的起始位点多为G，其次为，其次为A ，很少，很少为为U, 起始点核苷酸的两侧分别为起始点核苷酸的两侧分别为C 和和T。4、三元复合物的构成和、三元复合物的构成和因子的解离因子的解离 RNA合成一开场，就构成模板合成一开场，就构成模板-RNA pol-RNA的三元复合物。的三元复合物。 因子解离，中心酶与模板的亲和性下降到因子解离，中心酶与模板的亲和性下降到非特异性结合的程度，非特异性结合的程度，RNA pol在在DNA链上链上变得容易挪

17、动，为链的延伸发明了条件；变得容易挪动，为链的延伸发明了条件； 游离的游离的因子可以重新进展功能循环。因子可以重新进展功能循环。 转录的起始转录的起始 中心酶在中心酶在因子协助下特异性结合到因子协助下特异性结合到DNA上；上； RNA pol与启动子与启动子-35 box 结合，构成封锁型起始结合，构成封锁型起始复合物；复合物； 酶滑动到酶滑动到-10 box，转变成为开放型起始复合物，转变成为开放型起始复合物，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初的的2个核苷酸；个核苷酸； 酶继续加上开头的几个酶继续加上开头的几个NTP，构成三元起始复合，构成三

18、元起始复合物，在物，在RNA链合成了链合成了89个碱基后，个碱基后，因子解离，因子解离，转录开场。转录开场。 Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNAIncorporating the first few Nt二、原核生物转录的延伸二、原核生物转录的延伸 RNA pol沿着模板链挪动，沿着模板链挪动，RNA链不断延伸，链不断延伸，并坚持三元复合物的构造；并坚持三元复合物的构造； 转录泡中的转录泡中的DNA螺旋前开、后合，螺旋前开、后合，RNA延伸，延伸，不断脱离不断脱

19、离DNA； RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含链的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，转录就会减慢的区域，转录就会减慢/停顿。停顿。 17bp螺旋解开长度螺旋解开长度12bpDNA-RNA复合体长度复合体长度影响影响RNA延伸速度的要素：延伸速度的要素： RNA pol； 暂停信号：导致转录速度忽然出现变化的特暂停信号：导致转录速度忽然出现变化的特殊序列。殊序列。GC富集区：产物富集区：产物RNA不易释放；不易释放；IR：产物构成茎环构造，妨碍上游的模板恢复：产物构成茎环构造，妨碍上游的模板恢复双链。双链。 其他配基：其他配基：ppNpp、NusA蛋白。蛋白。NusA protei

20、n ： 69 Kd, acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol. pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substituting NusA + core E antitermination N protein utilization substanceNusA binds to polymerase, and N binds to both NusA and box B

21、 of the nut site region of the transcript, creating a loop in the growing RNA. This complex is relatively weak and can cause antitermination only at terminators near the nut site (These conditions exist only in vitro.). (Nut N binding site )antitermination N protein三、原核生物转录的终止三、原核生物转录的终止 转录的终止依赖于转录的

22、终止依赖于RNA产物的特定序列；产物的特定序列； 原核和某些真核生物的终止子要求转录产原核和某些真核生物的终止子要求转录产物物RNA 3端具有发夹的二级构造，茎部端具有发夹的二级构造，茎部富有富有GC序列；序列； 终止子的分类：终止子的分类： 根据终止反响能否需求根据终止反响能否需求蛋白蛋白1、不依赖于、不依赖于因子的终止子强终止子因子的终止子强终止子 构造特点：构造特点：RNA具有一个发夹构造富含具有一个发夹构造富含GC和随后和随后polyU片段。片段。 作用机制：作用机制：RNA pol + 发夹构造发夹构造 转录暂停转录暂停 后随杂合分子不稳定的后随杂合分子不稳定的poly(U-dA)

23、RNA容易从模板上零落容易从模板上零落RNA-DNA-RNA pol 解聚解聚 转录终止转录终止2、依赖于、依赖于因子的终止子弱终止子因子的终止子弱终止子 因子：因子：55kD，六聚体。可以利用水解，六聚体。可以利用水解ATP释放的能量使释放的能量使RNA从三元复合物中释放出从三元复合物中释放出来；来； 构造：依然具有茎环构造，但构造：依然具有茎环构造，但GC碱基对含碱基对含量较少，下游也缺乏量较少，下游也缺乏polyU构造。构造。 1、2、3、终止类型终止类型回文序列回文序列后随序列后随序列不依赖不依赖因子的终止子因子的终止子富含富含GC富含富含U依赖依赖因子的终止子因子的终止子不富含不富含

24、GC不富含不富含U第四节第四节 原核生物转录的调控原核生物转录的调控 基因表达的调控主要发生在转录程度；基因表达的调控主要发生在转录程度； 转录程度上的调控是最为经济、灵敏，又是最转录程度上的调控是最为经济、灵敏，又是最为重要、复杂的调控；为重要、复杂的调控； 确定需求转录基因的起始位点；确定需求转录基因的起始位点； 精细调理基因表达的程度；精细调理基因表达的程度； cis factor 与与 trans factor 严厉又灵敏的互作；严厉又灵敏的互作； 保证保证RNA pol的延续转录，准确终止。的延续转录，准确终止。一、原核转录调控的相关概念一、原核转录调控的相关概念 一诱导和阻遏：一诱

25、导和阻遏：诱导：酶的合成取决于特定物质常为诱导：酶的合成取决于特定物质常为substratesubstrate的存在。如培育基中乳糖的存的存在。如培育基中乳糖的存在促进了在促进了E.coliE.coli的半乳糖苷酶的合成；的半乳糖苷酶的合成；阻遏：当培育基中某种物质常为阻遏：当培育基中某种物质常为productproduct含量较高，细胞就封锁合成这种物质的才含量较高，细胞就封锁合成这种物质的才干。如培育基中干。如培育基中TrpTrp的存在抑制了的存在抑制了E.coli E.coli TrpTrp的合成；的合成；二调控的效应物二调控的效应物v调理蛋白调理蛋白 + 小分子物质小分子物质 原核支配

26、子的诱导原核支配子的诱导/阻阻遏。这些小分子是基因表达的调理物质遏。这些小分子是基因表达的调理物质-效应物。效应物。v诱导物诱导物inducer：与调理蛋白结合，使其从：与调理蛋白结合，使其从DNA分子上零落下来，分子上零落下来，RNA pol开场转录。开场转录。 v辅阻遏物辅阻遏物co-repressor：与调理蛋白结合，：与调理蛋白结合，可以提高伐节蛋白与支配基因的亲和性，进而可以提高伐节蛋白与支配基因的亲和性，进而封锁构造基因的转录。封锁构造基因的转录。三正调控和负调控三正调控和负调控 正调控：调理蛋白与支配子结合后促进正调控：调理蛋白与支配子结合后促进转录的进展。转录的进展。 负调控：

27、调理蛋白与支配子结合后抑制负调控：调理蛋白与支配子结合后抑制转录的进展。转录的进展。 正、负调控都存在着诱导和阻遏。正、负调控都存在着诱导和阻遏。positiveactiveinactiveInd.Rep. 正调控正调控 + 诱导诱导 调理蛋白无活性调理蛋白无活性转录不转录不进展进展 诱导物诱导物+调理蛋白调理蛋白有活有活性调理蛋白性调理蛋白转录进展转录进展 正调控正调控 + 阻遏阻遏 调理蛋白有活性调理蛋白有活性转录进转录进展展 辅阻遏物辅阻遏物+调理蛋白调理蛋白无无活性调理蛋白活性调理蛋白转录不进展转录不进展negativeactiveinactive 阻遏蛋白有活性阻遏蛋白有活性转录转录

28、不进展不进展 诱导物诱导物 + 阻遏蛋白阻遏蛋白无无活性阻遏蛋白活性阻遏蛋白转录进展转录进展 负调控负调控 + 诱导诱导 负调控负调控 + 阻遏阻遏阻遏蛋白无活性阻遏蛋白无活性转录转录进展进展 辅阻遏物辅阻遏物 +阻遏蛋白阻遏蛋白有活性调理蛋白有活性调理蛋白转录不转录不进展进展Ind.Rep.Negative二、支配子实际二、支配子实际operon concept 定义：原核生物基因表达和调控的单元。定义：原核生物基因表达和调控的单元。 包括：包括： 构造基因：编码控制某一代谢途径的相关的构造基因：编码控制某一代谢途径的相关的酶；酶； 调控元件：是调理构造基因转录的一段调控元件：是调理构造基因

29、转录的一段DNA序列，包括启动子和支配基因；序列，包括启动子和支配基因； 调理基因：其产物调理蛋白可以识别并调理基因：其产物调理蛋白可以识别并结合支配基因，决议构造基因的转录与否。结合支配基因，决议构造基因的转录与否。 一一lac支配子支配子lactose operon：1、lac支配子的构造支配子的构造调理基因调理基因I：编码阻遏物：编码阻遏物Repressor。启动子启动子Promoter，P：RNA pol的结合位点；的结合位点；支配基因支配基因Operator，O：进入构造基因的开关；：进入构造基因的开关；构造基因：构造基因：Z-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、Y-半乳糖苷透过半乳糖苷透过酶、

30、酶、A-半乳糖苷乙酰基转移酶半乳糖苷乙酰基转移酶 ；-半乳糖苷酶：水解含半乳糖苷酶：水解含-半乳糖苷键的底物，半乳糖苷键的底物，如乳糖。如乳糖。-半乳糖苷透过酶：使外界的半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷能透半乳糖苷能透过过E.coli细胞壁和原生质膜进入细胞内。细胞壁和原生质膜进入细胞内。-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰CoA+-半乳糖半乳糖苷苷乙酰半乳糖。乙酰半乳糖。 当当E.coli需求利用培育基里的乳糖时，前需求利用培育基里的乳糖时，前2种酶种酶是必需的，而最后是必需的，而最后1种酶那么是非必需的。种酶那么是非必需的。 没有乳糖没有乳糖lacI编码的阻遏蛋白具有活

31、性编码的阻遏蛋白具有活性结实结合到结实结合到支配基因支配基因O上上结合在启动区的结合在启动区的RNA pol不能经过不能经过Z、Y、A不能转录和表达不能转录和表达2、lac支配子的负向调控机制支配子的负向调控机制 负调控负调控 + 诱导诱导 参与乳糖参与乳糖乳糖诱导物与阻遏蛋白结合乳糖诱导物与阻遏蛋白结合阻阻遏蛋白构象变化遏蛋白构象变化 阻遏蛋白从支配基因上零落阻遏蛋白从支配基因上零落 RNA pol开场开场Z、Y、A基因的转录基因的转录表达表达乳糖被乳糖被利用利用 3、 lac支配子支配子CAP的转录激活作用的转录激活作用 正调控正调控 CAP：二聚体，可同时与：二聚体，可同时与DNA、cA

32、MP结合；结合； G存在存在细胞内细胞内cAMPCAP二聚体不能单二聚体不能单独与独与DNA结合结合lac 支配子封锁支配子封锁 G缺乏缺乏细胞内细胞内cAMP CAP与与cAMP结合结合 CAP-cAMP复合物复合物 + lac 支配子启动子上游支配子启动子上游 DNA链发生链发生90o弯曲弯曲 加强加强RNA pol与启动与启动子的结合子的结合 lac 支配子翻开支配子翻开 Z、Y、A基因转基因转录、表达录、表达CAPv乳糖支配子的协同调理乳糖支配子的协同调理(coordinate regulation)v负向调理与正性向调理协同协作负向调理与正性向调理协同协作v阻遏蛋白封锁转录时，阻遏蛋

33、白封锁转录时，CAP不发扬作用不发扬作用v如没有如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从加强转录，即使阻遏蛋白从lacO上上s释放仍无转录活性释放仍无转录活性v结论：结论：lac支配子强的诱导作用既需求乳糖又支配子强的诱导作用既需求乳糖又需缺乏葡萄糖需缺乏葡萄糖二二trp支配子支配子 Trp的合成：一系列酶促反响的结果分支酸的合成：一系列酶促反响的结果分支酸 邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸 吲哚甘油磷酸吲哚甘油磷酸 Trp； 1、trp支配子的阻遏系统转录起始的调理支配子的阻遏系统转录起始的调理 有有Trp：Trp结合并激活阻遏蛋白，阻断转录；结合并激活阻遏蛋白，阻断转录； 无无Trp：阻遏蛋白无活性，支配子基因开场转录。：阻遏蛋白无活性，支配子基因开场转录。2、 trp支配子的弱化系统支配子的弱化系统转录提早终止的调转录提早终止的调理理1衰减子衰减子