山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析

1、第32卷第6期渔业科学进展V0132，No62 0 1 1年1 2月PROGRESS IN FISHERY SCIENCESDec，2011山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析赵玉然12岳志芹2 谭乐义2 马亚1李琼3梁成珠2 李八方H(1中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266003) (2山东出入境检验检疫局技术中心，青岛266002) (3江西出入境检验检疫局综合技术中心，南昌330046)摘 要 2008年11月2010年11月，采集山东海域大菱鲆、石鲽、鲈鱼各20批，按照世界动物卫 生组织推荐的PCR检测方法对真鲷虹彩病毒病(Red Sea Bream Iridoviral

2、 Disease，RSIVD)进行初 步调查。结果显示，共检出4例RSIVD感染样品。以真鲷虹彩病毒(Red Sea Bream Iridovirus， RSIV)和传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV)主要衣壳蛋白 基因为基础，设计简并引物，PCR扩增本次检出阳性样品的RSIVISKNV MCP基因。将MCP基因 PCR扩增产物测序，提交GenBank，并以MCP基因为基础，对被检出的阳性样品进行虹彩病毒属系 统分类，绘制进化树。由进化树得出，4例阳性病毒株均属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属。关键词 真鲷虹彩病毒传

3、染性脾肾坏死病毒PCR MCP基因同源性 中图分类号 S943文献识别码 A文章编号1000一_7075(2011)060031一06PreliminaIy inVestigation and analysis of red sea bream iridoViral disease(RSIVD)in some coastal areas of Shandong ProVinceZHAO Yuranl2 YUE Zhiqin2 TAN Leyi2 MA Yal LI Qion93LIANG Chengzhu2LI Bafan91。(1 CoUege of F00d Science and Eng

4、ineering，0cean UniVersity of China，Qingdao 266003) (2Shandong Technical Center of In童pection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002) (3Jiangxi EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Nanchang 330046)ABSTRACTDuring Nov2008Nov2010，20 batches of turbot Sco声娩口Zm“s mnzim乱5， stone flounder KnrPZ“s 6ZfoZo

5、r口芒乱s，and perch PPrc口“口iaffZis were respectively collected from some coastal areas of Shandong Province， and the infection of red sea bream iridoviral disease (RSIVD)was investigated using PCR method recommended by the World 0rganization for Ani mal HealthThe result showed that the RSIVD was detecte

6、d in four samDlesBased on the maj or capsid protein(MCP)gene of the two standard strains of red sea bream iridovirus and infectious spleen and kidney necrosis virus， degenerate primers were designed for PCR， and the MCP gene in the four positive samples were amplified and submitted to GenBankThe phy

7、loge netic tree was drawn，and it was found that all of four isolated virus strains belonged to Iegalocytivirus genus of IridoviridaeKEY WoRDS Red Sea bream iridovirus Infectious spleen and kidney necrosis virus国家质量监督检验检疫总局科研项目(2007IK267)和质检总局公益性项目(10一71)共同资助*通讯作者。E-mailbfliouceducn，Tel：(0532)8203185

8、2 收稿日期：2011一0228；接受日期：2011一0512 作者简介：赵玉然(1983一)，女，博士，主要从事水生动物疫病检验检疫研究。E-mail：ran-007163com万方数据渔业科学进展第32卷 PCRMaj or capsid protein gene Homology虹彩病毒(Iridovirus)是一类大型的胞浆型DNA病毒。根据国际病毒分类学委员会(The International Committee on Taxonomy of viruses，ICTV)第八次报告，虹彩病毒科Iridoviridae分为5个属，包括感染脊椎 动物的蛙病毒属R彻舢ir“s、细胞肿大病毒

9、属如g口zocyi可ir“s和淋巴囊肿病毒属Lympocys细ir乱s，以及感染无脊椎动物的虹彩病毒属J以do沈r“s、绿虹彩病毒属吼zo以，ido说，“s(Jakob以nz2001)，前3个属的虹彩病毒可感染多种水生经济动物并分布全球，目前对其研究较为广泛。真鲷虹彩病毒病(Red Sea Bream Iridovirus Disease，RSIVD)是目前流行较广、研究较多的虹彩病毒病，该 病最早暴发于日本(Inouye gnz 1992)，随后，在东亚、东南亚国家相继暴发(Chou以口z 1998；Chua甜 口z 1994；Do以口z 2005；Gibso矿kueh以nz 2004)。R

10、SIVD暴发突然，致死率高，给水产养殖业带来巨 大的损失，严重影响经济鱼类的进出口贸易。鉴于其危害性，多年来该病一直被列为世界动物卫生组织必检疫 病，我国农业部将其列为二类疫病。OIE水生动物疾病诊断手册(Office International Des EpizOoties，Manual of Diagnostic Tests for Aquatic animals)(2009)认为，RSIVD是由真鲷虹彩病毒(Red Sea Bream Iridovirus， RSIV)和传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis virus，ISKNV

11、)两种病毒引起的(Inoue g口z 1992；He以nz 2001)。两种病毒基因同源性较高，但对感染宿主又有着明显的区别。近年来，随着 越来越多的真鲷虹彩病毒同源变异病毒株的发现，真鲷虹彩病毒家族也在不断壮大。本实验采用OIE推荐的真鲷虹彩病毒病检测方法，对山东海域部分地区进行了RSIVD的初步调查，应用 PCR技术扩增了阳性样品的病毒MCP全基因，并以MCP基因为分类依据，对检出的病毒株进行了虹彩病毒 科的同源性比对与系统分析，以便及时了解我国RSIVD的流行动态，为该病的防控奠定良好的实验基础，促 进水生动物贸易的良好发展。1 材料11 实验样品2008年11月20lO年11月，在山东

12、沿海黄岛、青岛、威海、日照、荣成共采集鲜活鲈鱼20批、石鲽20批、 大菱鲆20批，每批样品30尾。RSIV、ISKNV核酸由本实验室保存。12试剂与仪器121试剂DNA提取试剂盒(TaKaRa)、EX T口q(TaKaRa)、Marker DL2000(TaKaRa)、BigDye Terminator V11试剂盒(ABI)。122仪器PCR仪(Eppendorf)，紫外凝胶成像分析仪(天能)，离心机(Eppendorf)，ABI 3130基因测序仪。2方法21样品的前处理 取每批样品脑、脾、肾组织，每5尾混合为一个平行样进行低温快速研磨，一80保存备用。22引物的设计用于RSIVD初步调查

13、的PCR引物参照OIE(2009)，该引物扩增RSIVISKNV基因570bp的核苷酸片 段，引物序列为：RSIVDF：5一CTCAAACACTCTGGCTCATCl3万方数据第6期 赵玉然等：山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析33RSIVDR：5一GCACCAACACATCTCCTATC一3通过对RSIV(GenBank Accession No：BDl43114)和ISKNV(GenBank Accession No：AF371960)MCP基 因的相似性比对，由Primer 5o软件设计RSIVD MCP基因的PCR扩增简并引物，扩增片段长1 367bp(含 MCP全基因1 3

14、62bp的核苷酸序列)，引物序列为：MCPF：5一TTACAGGATAGGGAAGCCT一3 MCPR：5一TCATCATGTCTGCRATCTCA一3，23 RsIVD初步调查参照OIE(2009)推荐的方法，利用RSIVF、RSIVR PCR引物对山东海域采集到的待检样品进行RSIV ISKNV检测。采用DNA提取试剂盒(TaKaRa)从鱼样品组织匀浆液中提取核酸，进行PCR扩增。PCR扩增体系：核酸2肛1，125弘l ExT口q(含dNTP、M92+的Buffer混液，TaKaRa)，上、下游引物(10弘molL)各1肛l， 加水补充至总体积25 ul。PCR反应参数：94变性4 min

15、；94变性1 min、58退火1 min、72延伸1 min，35次循环；72延伸10 min；4保温。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。24 RsIVD阳性检出样品MCP基因的序列分析241 RSIVISKNV MCP基因PCR扩增利用设计的RsIVISKNV MCP基因简并引物对RSIVD阳性样品进行虹彩病毒MCP基因的PCR扩 增。反应体系为：核酸样品2肛l，o5肛1 LA nq(5U肛1)，上、下游引物(10肛molL)各1肛l，10xLA死q PCR Buffer(M92+plus)5肛l，dNTP MIX(dNTP各25 mmolL)8肛1，加水补充至总体积50肛l。PCR扩增

16、参 数：94变性1 min；94变性30 s、54退火30 s、72延伸1 min，30次循环；72延伸lo min；4保温。扩 增产物经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。242 RSIVISKNV MCP基因的序列分析利用ABI 3130基因测序仪，对阳性样品RSIVISKNV MCP基因PCR产物进行测序，测序反应采用ABIBigDye Terminator V11试剂盒，测序结果提交GenBank。243 系统树的绘制 利用MegAlign软件将检出的阳性病毒株与虹彩病毒科各个属代表株进行MCP基因的相似性比对并绘制系统树，对阳性病毒株进行系统分析，各属代表病毒株详情见表1。3 结果31 RS

17、IVD的初步调查结果 在被调查的60批鱼类样品中，4批样品呈PCR阳性(570bp)(图1)，受感染鱼类包括鲈鱼、石鲽、大菱鲆3种海水鱼类。32 RSIVISKNV MCP基因的PCR扩增与测序结果4例阳性病毒株MCP基因的PCR扩增电泳见图2(1 367bp，含MCP全基因1 362bp)。将4例RSIVD阳 性样品信息与RSIVISKNV MCP基因PCR扩增产物测序结果提交GenBank，获得基因序列号分别为 HQ263622、HM596017、HQ263621、HQ263620。阳性检出样品信息与GenBank序列号对应关系见表2。33系统树的绘制 将获得的4例病毒株与表1中代表株进行

18、MCP基因比对，绘制系统树(图3)。从图3可以得出，4例病毒株均归属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属，HQ263622、HM596017、HQ263621与ABl66788(TBIV)、AY590687(TRBIV)同源关系最近，HQ263620与AY894343(0SGIV)、AY532606(RBIV)同源关系最近。万方数据34渔业科学进展第32卷B I2，4 hM B：纛：暑M：DL2000；B空白对照l：石肆(2008年11月黄岛)IM：DL2000；B；空白对照；2：大菱鲆(2008年11月黄岛)l14：分别是HQ263622、3：鲈鱼(2008年12月，荣成)4：石镰(20lO年lO月日

19、照)HM596017、HQ263621、HQ263620I MDL2000I BBI蚰k CroII l_甄one nounder(Nov M：DL2000B：Blank contrdll4：HQ263622，2008，H咖gd80)2 Turbot(Nov2008，H gddo)lHM596017HQ263621HQ263620 respectiveIy3 Perch(Dec2008Ro“gcheng)I圈24例RsIVD阳性样品McP基因PCR4Stonc nounder(0ct20lORizhao)扩增产物电泳圈l RslVD初步调查阳性检出样品PcR扩增产物电泳Fig2 Agarose

20、 geI electrophoresis of the PCR pmductFig1 A軎aros。gel electrophoresis ofthe PcRof MCP gene in four RSlVD positive sampIesproduct of f。ur RSlVD p03iti amPIes寰l虹彩科各一毫基因序列号Table 1 The viru3es in“mily lndovirid洲nd their GenBank accessi umber新西兰肋魍鳃金龟虹彩病毒AF025775无脊椎动物虹彩病毒Costel ytrazealandica iridescenl v

21、trus(CZlV)Invertebrate iridovirus 昆虫虹彩病毒AF02577dWiseana iridescenl virus(WIV)细胞肿大病毒属传染性脾肾坏死病毒AF371960M。gnl眦，ti硝rHs lnfIious spIe nd kidney necsi3 v；rus(ISKNV)斜带石斑鱼虹彩病毒AY894“3orange_5potted gmuper idoviru3(OSGlV)条石一虹彩病毒RBIVK()RTYl病毒株AY532606Rock briridovirussl弛n RBIVKoRTYl(RBIV)大菱解虹彩病毒ABl66788Turbot

22、irldo“rus(TBIV)大菱许红体病虹彩病毒AY590687Turbot reddish bodv iridovirus(TRBIV)真龋虹彩病毒Em1病毒株Rcd sea_biridovirus EhimPl s【rain(RSIV)淋巴囊肿病毒属 淋巴囊肿病毒一cAY380826L”ph“yilbirusLymphocy“s di e virus-C(LCDVC)淋巴囊肿病毒1L6355Lymphocystis disea5e vIrus-l(LCDv_1)蛙病毒属 流行性遗血器官坏死病毒Y187045R口帕“rHjEpizootic haIopoietic n嘲osis virus

23、(EHNV)新加坡石斑盈虹彩病毒AY521625!坚!罂!g!生：!：!墅!万方数据第6期 赵玉然等：山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析3570660 50 40 30 20 10Nucleotide Substitutio璐(100)HQ26362z、HM596017+、HQ263621+、HQ263620：新分离病毒株Newly isolated strains图3根据虹彩病毒MCP基因序列绘制的系统树Fig3 The phylogenetic tree based on the MCP gene of Iridovirus4讨论真鲷虹彩病毒是目前研究较多的一类虹彩病毒，该病毒流

24、行范围广、致死性强。真鲷虹彩病毒病是由真鲷 虹彩病毒及其变异病毒株引起的一类破坏性病毒病，该病主要感染真鲷、石鲽、大菱鲆、鲈鱼等30多种鱼类。 被感染的鱼类具有昏睡、严重贫血、鳃有淤点、脾肿大的症状。通过革兰氏染色对患病鱼的脾、肾、心脏进行组 织病理学观察，可观察到肿大的细胞着色较深，这是该病的主要特征(Jung甜nz 1997)。夏季水温在25 或高于此温度时，该病易暴发。1990年，该病首次暴发于日本，引起了日本西部养殖鱼类的大量死亡。随后， 在亚洲的东部和东南部国家也被发现。2003年，我国深圳出入境检验检疫局在台湾送检的两批海水鲈鱼苗中 检出该病，在山东沿海城市也陆续出现了相近虹彩病毒

25、变异株。ISKNV为我国首次发现的可感染淡水鱼类的 虹彩病毒(He P口z 2001；Sudthongkong甜口z 2002)，在OIE(2009)水生动物疫病诊断手册中该病原被 列为真鲷虹彩病毒病病原之一。按照OIE(2009)推荐的检测方法，对我国山东海域RSIVD进行初步调查。结果表明，山东沿海海域共检 出4批RSIVD阳性样品，受感染鱼种为石鲽、大菱鲆和鲈鱼，此3种鱼类为山东地区主要经济鱼类，该病原的 发现对山东渔业养殖经济、经济鱼类的进出口贸易带来了不利影响，必须采取积极有效的防治措施，控制病原 携带个体的运输，防止病毒的传播。虽然，由于温度和宿主自身条件等因素的影响，该病目前未暴

26、发疫情，但由 于病原的检出，必须做好相应的监管工作，以防止疫病的暴发与蔓延。由于RSIVISKNV没有合适的细胞培养系，无法进行病毒增值培养与分离，PCR检测方法仍旧是OIE (2009)推荐的主要检测方法，又由于PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便且普遍适用的优点，该 检测方法已成为我国水生动物病毒检测的主要方法，与其他水生动物检测方法如荧光定量PCR、酶联免疫检 测方法(ELISA)、组织病理学相比较，该检测方法不需要设计昂贵的探针，成本低廉，不需要昂贵的仪器，适用 于未出现临床症状期间的早期检测，可用于疫病的防控，更适合在我国有效推广。万方数据36渔业科学进展第32卷目前，针对

27、虹彩病毒PCR检测的靶序列有很多种，包括DPOL、ATP酶基因、P豇I限制性位点、核酸还原 酶小亚基(RNRS)基因等(Jeong以nz 2006)，但由于GenBank不能提供上述基因的详尽的比对序列，因此 本实验设计了以MCP基因做为靶序列的检测方法，可以更好地研究病毒株的分类地位，而MCP基因由于其 特异性、保守性(Tidona P口z 1998；Paperna以口z 2001)，更适合作为虹彩病毒科系统分类的依据。本实 验通过对RSIV与ISKNV MCP基因的同源性比较，设计简并引物，PCR扩增了RSIVD病原MCP基因的全 序列，建立了以MCP基因为基础的RSIVD PCR检测方法

28、，该方法的建立可以满足RSIVD常规检测的要求， 并为虹彩病毒的系统分类奠定了实验基础。通过此次调查，获得4例RSIVD阳性病毒株，通过与虹彩病毒科5个病毒属(包括3个脊椎动物病毒属和 两个无脊椎动物病毒属)代表病毒株同源序列的比对，绘制系统进化树，可以得出，所分离病毒株均属于虹彩病 毒科细胞肿大病毒属，是我国目前主要流行的虹彩病毒属，遗传性质稳定，他们的最大相似株分别是OSGIV、 TRBIV和TBIV，其中TRBIV和TBIV这两株病毒株都是近些年来在我国被检出(Shi Pnz 2004)，该病毒 属与蛙病毒属、无脊椎动物虹彩病毒(包括绿病毒属和虹彩病毒属)、淋巴囊肿病毒属这些早期发现的病

29、毒属有 较远的亲缘关系。本次系统分析，可做为今后虹彩病毒分类以及命名的参考，具有一定的实际应用价值，为该 病更深入的研究奠定了一定的理论基础。参考文献Chou，HY，Hsu，CC，and Peng，TY1998Isolation and characterization of a pathogenic iridovirus from cultured grouper(Ei挖P声PZMss声)in TaiwanFish Path0133(4)：201206Tidona，CA，Schnitzler，P，Kehm，R，and Darai，G1998Is the major capsid protei

30、n of Iridovirus a suitable target for study of viral ev01ution?Virus Genes，16(1)：5966Chua，FHC，Ng，ML，Ng，KL，Loo，JJ，and Wee，JY1994Investigation of outbreaks of a novel disease，“S1eepy Grouper Disease”，affecting the brownspotted grouper，Epi雄8peZ“s口铆i扎口ForskalFish Dis17(4)：417427Do，JW，Cha，SJ，Kim，JS，An，EJ

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