酶学通论课件

1、酶学通论第八章第八章 酶学通论酶学通论酶学通论 酶学通论一、酶学研究史一、酶学研究史酶学通论酶学研究史酶学研究史酶学通论二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂酶学通论酶学通论例例 2H2H2 2O O2 2 2H 2H2 2O + OO + O2 2 反反 应应活化能活化能非催化反应非催化反应75.24kJ/mol75.24kJ/mol钯催化反应钯催化反应48.9kJ/mol48.9kJ/molH H2 2O O2 2酶催化酶催化8.36kJ/mol8.36kJ/mol酶学通论（1 1）高的催化效率）高的催化效率 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化

2、学催化剂高剂高10107 710101313倍，比非催化反应高倍，比非催化反应高10108 810102020倍。倍。 例例 2H2H2 2O O2 22H2H2 2O+OO+O2 2 1mole H1mole H2 2O O2 2酶酶 能催化能催化 5 510106 6mole Hmole H2 2O O2 2的分解的分解 1mole Fe1mole Fe3+3+ 只能催化只能催化6 61010-4-4mole Hmole H2 2O O2 2的分解的分解 酶学通论酶与一般催化剂催化效率的比较酶与一般催化剂催化效率的比较底物底物 催化剂催化剂 反应温度反应温度 反应速度常数反应速度常数尿素尿

3、素 H + 62 7.4 10-7 脲酶脲酶 21 5.0 106过氧化氢过氧化氢 Fe 2+ 22 56 过氧化氢酶过氧化氢酶 22 3.5 107酶学通论转换数（转换数（turnover number,kturnover number,kcatcat）: : 每秒钟或每分每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。 酶学通论 如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修

4、饰调节、酶原活化等。价修饰调节、酶原活化等。 反应条件温和反应条件温和 生物固氮：生物固氮： 工业氨合成：工业氨合成：5.5.酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关 N2+3H2 500 ,300大气压大气压Fe2NH3酶学通论6CO2+6H2O+能量能量 C6H12O6+6O2 植物植物动物动物N N2 2 + 3H + 3H2 2 2NH 2NH3 3某些微生物某些微生物酶学通论三、酶的化学本质三、酶的化学本质 1 1大多数酶是蛋白质大多数酶是蛋白质19261926年美国年美国SumnerSumner脲酶的结晶，并指出酶是蛋白脲酶的结晶，并指出酶是蛋白

5、质。质。19301930年年NorthropNorthrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。蛋白质。 J.B.SumnerJ.H.Northrop酶学通论 20 20世纪世纪8080年代发现某些年代发现某些RNARNA有催化活性，还有有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些一些抗体也有催化活性，甚至有些DNADNA也有催化活也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。 酶的定义：酶的定义：生命体内具有催化化学反应活性生命体内具有催化化学

6、反应活性的蛋白质为酶。的蛋白质为酶。 酶为生命体内具有催化化学反应活性的生物酶为生命体内具有催化化学反应活性的生物大分子。大分子。 酶学通论四、酶的组成四、酶的组成 1 1单纯蛋白质酶类单纯蛋白质酶类 仅由氨基酸组成。仅由氨基酸组成。 如脲酶、如脲酶、胃蛋白酶等一般水解酶。胃蛋白酶等一般水解酶。2 2缀合蛋白质酶类缀合蛋白质酶类 蛋白质蛋白质 + + 非蛋白质部分非蛋白质部分 全酶全酶 = = 脱辅酶（酶蛋白）脱辅酶（酶蛋白）+ +辅助因子辅助因子 （辅酶、辅基或金属离子）（辅酶、辅基或金属离子）辅酶（辅酶（coenzymecoenzyme） 辅基（辅基（prosthetic grouppro

7、sthetic group） 酶学通论 全酶全酶 (holoenzyme) | 酶蛋白（酶蛋白（apoenzyme) + 辅助因子辅助因子 （cofactor) cofactor 辅基，辅基， prosthetic group辅酶，辅酶，co-enzyme金属离子金属离子结合力强结合力强酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅助因子酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅助因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的传递体。通常是作为电子、原子或某些化学基团的传递体。酶学通论v单体酶（单体酶（monomeric enzyme)monomeric enzyme)：由一条肽链组：由一条肽链组成，全部参与水

8、解反应。成，全部参与水解反应。v寡聚酶寡聚酶 (oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)：由几个或多个：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。大多有催化活性。亚基之间以非共价键结合。大多为代谢调控酶。为代谢调控酶。根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类酶学通论v 多酶复合体多酶复合体 (multienzyme complex)(multienzyme complex)：几个酶嵌合而成的复合物。这些酶催化将底物转化几个酶嵌合而成的复合物。这些酶催化

9、将底物转化为产物的一系列顺序反应。如丙酮酸脱氢酶复合体为产物的一系列顺序反应。如丙酮酸脱氢酶复合体由丙酮酸脱氢酶（由丙酮酸脱氢酶（EE）、硫辛酰转乙酰酶（）、硫辛酰转乙酰酶（EE）和二氢硫辛酰脱氢酶（和二氢硫辛酰脱氢酶（EE）组成。）组成。酶学通论五、酶的命名和分类五、酶的命名和分类 1961 1961年国际酶学委员会（年国际酶学委员会（enzyme commissionenzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。提出的酶的命名和分类方法。 每一个酶由下列三种表示：每一个酶由下列三种表示： 1 1、系统名称：底物名、系统名称：底物名+ +反应性质反应性质 2 2、分类编号：、

10、分类编号：E.C.+E.C.+四个数字四个数字 3 3、推荐名：选一个习惯名（实用、简单）、推荐名：选一个习惯名（实用、简单） 酶学通论（一）命名（一）命名 1 1系统名称（系统名称（systematic namesystematic name） （1 1）标明底物和催化反应的性质）标明底物和催化反应的性质 G-6-PF-6-P G-6-PG-6-PF-6-P G-6-P异构酶异构酶 例例: :酶学通论（2 2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（冒号（: :）分开。如其中一个底物为水时，水可）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。略去。 例例1 1

11、： 丙氨酸丙氨酸+-+-酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸+ +丙酮酸丙酮酸 丙氨酸丙氨酸:-:-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶 例例2 2： 脂肪脂肪+H+H2 2O O 脂酸脂酸+ +甘油甘油 脂肪水解酶脂肪水解酶 酶学通论2 2习惯名称（习惯名称（recommended namerecommended name） （1 1）底物）底物 （2 2）反应性质）反应性质 （3 3）底物）底物+ +反应性质反应性质 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 （4 4）底物）底物+ +来源或其它特点来源或其它特点 酶学通论（二）系统分类法及编号（二）系统分类法及编号 1 1分类分类: : 根据催化反应的性质分根据催

12、化反应的性质分6 6大类酶大类酶 1.1.氧化还原酶类氧化还原酶类 oxidoreductaseoxidoreductase 2.2.转移酶类转移酶类 transferase transferase 3.3.水解酶类水解酶类 hydrolase hydrolase 4.4.裂合酶类裂合酶类 lyaselyase 5.5.异构酶类异构酶类 isomerase isomerase 6.6.连接酶类连接酶类 ligase/synthetaseligase/synthetase酶学通论2 2编号编号: : 用用4 4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以隔开

13、，前面冠以ECEC（为（为Enzyme CommissionEnzyme Commission）。）。EC EC 类类. .亚类亚类. .亚亚类亚亚类. .排号，如排号，如EC l.1.1.1 EC l.1.1.1 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第1亚类，氧化基团亚类，氧化基团CHOH第第1亚亚类，亚亚类，H受体为受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号酶学通论（三）六大类酶催化反应的性质（三）六大类酶催化反应的性质 1 1氧化还原酶类（氧化还原酶类（oxido-reductasesoxido-reductase

14、s） 主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。催化氧化还原反应的酶，包括氧化反应。催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。酶等。 酶学通论（1 1）氧化酶类：）氧化酶类： 催化底物脱氢，并氧化生成催化底物脱氢，并氧化生成H H2 2O O或或H H2 2O O2 2 。2A2A2H2H+O+O2 2 2A+22A+2H H2 2O O AA2H2H+O+O2 2 A+A+H H2 2O O2 2 酶学通论例：邻苯二酚氧化酶例：邻苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1EC 1.10.3.1

15、，邻苯二酚：氧氧化酶），邻苯二酚：氧氧化酶） 邻苯二酚邻苯二酚邻苯醌邻苯醌OHOH+ O2邻邻苯苯二二酚酚氧氧化化酶酶OO2+ 2H2O2酶学通论（2 2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢）脱氢酶类：直接催化底物脱氢 AA2H2H + B + B A + BA + B2H2H 例：乳酸脱氢酶（例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27EC 1.1.1.27） L-L-乳酸：乳酸：NADNAD+ +氧化还原酶）氧化还原酶） 乳酸乳酸丙酮酸丙酮酸COOHC HCH3H O+ NAD+COOHCOCH3+ NADH + H+乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶酶学通论2 2转移酶类（转移酶类（transferasestran

16、sferases） 催化基团的转移催化基团的转移, ,分成分成8 8个亚类：转移碳基、酮个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。基和含硫基的酶。 AR+ BBRA +例：谷丙转氨酶（例：谷丙转氨酶（GPTGPT）（）（EC 2.6.1.2EC 2.6.1.2） L-L-丙氨酸：丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶）酮戊二酸氨基转移酶） 酶学通论3 3水解酶类（水解酶类（hydrolaseshydrolases） AB + AB + H H2 2O O A AOHOH + B + BH H 催化加水分解作用。催化加水分解作用。酶

17、学通论4 4裂合酶类（裂合酶类（lyaseslyases） 从底物非氧化非水解性地移去一个基团并形成双从底物非氧化非水解性地移去一个基团并形成双键的反应或其逆反应。键的反应或其逆反应。 A AB B A A + + B B 例例1 1：酶学通论例例2 2：酶学通论5 5异构酶类（异构酶类（isomeraseisomerase） 催化异构化反应催化异构化反应 , ,常见的有消旋和变旋、醛酮常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。异构、顺反异构和变位酶类。例：例：AB酶学通论6 6连接酶类（连接酶类（ligases, ligases, 也称也称synthetasessynthetases

18、合成酶类）合成酶类） 将两个小分子合成一个大分子，通常需要将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATPATP供能。供能。 例：例： 乙酸+CoASH+ATP 乙酰SCoA+AMP+PPiA + B + ATP AB + ADP + PiA + B + ATP AB + AMP + PPi酶学通论（连接酶）（异构）（裂合）（水解）酶学通论酶学通论酶作用的酶作用的专一性专一性结构结构专一性专一性立体异构立体异构专一性专一性相对专一性相对专一性绝对专一性绝对专一性六、酶专一性六、酶专一性 specificityspecificity键的专一性键的专一性基团专一性基团专一性酶学通论1、绝对专一性（、绝对

19、专一性（absolute specificity） 只能作用于某一底物。只能作用于某一底物。 例例: CONH2NH2H2O脲脲酶酶CO2 + 2NH3CONH2NHCH3H2O脲脲酶酶X酶学通论（1 1）族专一性（基团专一性，）族专一性（基团专一性，group specificitygroup specificity） 2 2、相对专一性（、相对专一性（relative specificityrelative specificity） 作用于一类化合物。作用于一类化合物。 A A B B或或A A B B如如-D-D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 OCH2OHOHOHOOHR酶学通论（2 2）键专一

20、性）键专一性 作用一种化学键作用一种化学键A BA BR1COOR2+ H2O酯酯酶酶R1COOH + R2OH酶学通论2 2、立体专一性（、立体专一性（stereospecificitystereospecificity）只能催化一种立体异构体进行反应。只能催化一种立体异构体进行反应。 （1 1）D-D-，L-L-立体异构专一性立体异构专一性 L-L-乳酸脱氢酶：作用于乳酸脱氢酶：作用于L-L-乳酸乳酸CH3CCOOHOCH3CCOOHHO H + NAD+ NADH + H + +LDH酶学通论（2）几何异构专一性）几何异构专一性 延胡索酸酶：作用于反式的丁烯二酸延胡索酸酶：作用于反式的丁

21、烯二酸COOHCH2CH2COOHHOOCCOOHCCHH+ FAD+ FADH2SDH酶学通论（3 3）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等同的基团，只催化其中的一个基团，而不中两个等同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。催化另一个。 例例1 1： CH2OHCHCH2OHHO14+ ATP甘甘油油激激酶酶CH2CHCH2OHHO14OP+ ADP若甘油激酶不能区分两个若甘油激酶不能区分两个CHCH2 2OHOH基团，则会生成基团，则会生成 : :CH2CHCH2OHHO14OPCH2OHCHCH2HO14OP和和酶学通论例例2

22、 2： DC OHDH3C+NCHCONH2R+4NAD+ D（重氢）- DNCCONH2R4NAD 辅辅酶酶的的还还原原型型HD( ( A型型 ) )+H3CCDO酶学通论关于酶作用专一性的几种假说关于酶作用专一性的几种假说 1 1、锁钥学说（、锁钥学说（lock and Key theorylock and Key theory） 18941894年年 Fischer Fischer 提出提出: :酶的活性中心结构与底酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。酶学通论2 2、三点附着学说、三点附着学说 酶学通论3 3、诱导契合学说（

23、、诱导契合学说（induced-fit theoryinduced-fit theory） 19581958年年 Koshland Koshland 提出提出: :酶活性中心的结构有酶活性中心的结构有一定的柔性，当酶分子与底物酶分子接近时，一定的柔性，当酶分子与底物酶分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，构象发生了有利于与酶蛋白受底物分子诱导，构象发生了有利于与底物结合的变化，使活性中心的有关基团正确底物结合的变化，使活性中心的有关基团正确地排列和定向，酶和底物契合结合成中间络合地排列和定向，酶和底物契合结合成中间络合物，引起底物发生反应。物，引起底物发生反应。酶学通论酶学通论v酶活力（酶活力（e

24、nzyme activityenzyme activity）是指酶催化某一化学）是指酶催化某一化学反应的能力。反应的能力。 七、酶的分离纯化和活力测定七、酶的分离纯化和活力测定产产 物物 浓浓 度度 PP(t)(t)酶学通论测定酶活力时应注意几点测定酶活力时应注意几点 （1 1）应测反应初速度（）应测反应初速度（initial velocityinitial velocity） 底物浓度变化在起始浓度底物浓度变化在起始浓度5%5%以内。以内。 （2 2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。加量来表示。 （3 3）测酶活力时应使反应温度、）测酶活

25、力时应使反应温度、pHpH、离子强度和、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。底物浓度等因素保持恒定。 （4 4）测定酶反应速度时，应使）测定酶反应速度时，应使SESE。 酶学通论（ U ） ：在一定条件下，一定时间：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量（内将一定量的底物转化为产物所需的酶量（U/g，U/ml） 。v在最适的反应条件（在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即位，即 1IU=1mol/minv在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产在最适条件下，每秒

26、钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为物所需的酶量定为1kat单位，即单位，即1kat=1mol/sv酶的酶的 （代表酶的纯度）：每（代表酶的纯度）：每mg蛋白质所蛋白质所含的酶活力单位数。含的酶活力单位数。酶学通论 酶的比活力或比活性（酶的比活力或比活性（specific activityspecific activity） 比活力：指每比活力：指每mgmg蛋白质所具有的酶活力，一般用蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mgU/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。 比活力比活力= = 酶活力（酶活力（U/mlU/ml）/ /蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/m

27、lmg/ml） 比活力有时也可用每比活力有时也可用每g g或每或每mlml酶含多少个活力单酶含多少个活力单位来表示。位来表示。 酶学通论 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 （1 1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometryspectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。光吸收不同。 优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测定；可检测到定；可检测到10-9mol/L10-9mol/L水平的变化。水平的变化。例例: : 人血清乳酸脱氢酶活力的测定人血清乳酸脱

28、氢酶活力的测定 L-L-乳酸乳酸 + NAD+ NAD+ + 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ NADH + H+ + 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶酶学通论酶学通论（2 2）荧光法（）荧光法（fluorometryfluorometry） 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可测主要的优点：灵敏度很高，可测1010-12-12mol/Lmol/L的的样品。样品。 酶蛋白分子中的酶蛋白分子中的TyrTyr、TrpTrp、PhePhe残基以及一些残基以及一些辅酶、辅基，如辅酶、辅基，如NADH NADPHNADH NADPH、FMNFM

29、N、FADFAD等都等都能发出荧光。能发出荧光。 例：乙醇例：乙醇 + NAD+ NAD+ + 乙醛乙醛 + NADH + H+ NADH + H+ + 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶酶学通论（3 3）酶偶联分析法）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) (enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。个酶系统在一起反应。 2P 2E1P 1E S P P1 1无光吸收或荧光变化，偶联后无光吸收或荧光变化，偶联后, P, P2 2有光吸有光吸收或荧光变化。收或荧光变化。酶学通论例：测己糖激酶的

30、活性例：测己糖激酶的活性 葡萄糖葡萄糖 + ATP + ATP 葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸 + ADP + ADP 己糖激酶己糖激酶葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸 + NADP + NADP 葡糖酸葡糖酸-6-6-磷酸磷酸 + NADPH + H+ NADPH + H+ + G-6-PG-6-P脱氢酶脱氢酶酶学通论（4 4）电化学法（）电化学法（electrochemical methodelectrochemical method） 有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子离子选择性电极法要求在酶反应中必

31、须伴随有离子浓度的变化或气体的变化（如浓度的变化或气体的变化（如O O2 2、COCO2 2、NHNH3 3等）。等）。 例例: : 葡萄糖氧化酶活性的测定葡萄糖氧化酶活性的测定 葡萄糖葡萄糖+O+O2 2+H+H2 2O O 葡糖酸葡糖酸+H+H2 2O O2 2 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（5 5）同位素法）同位素法酶学通论1 1选材选材 2 2破碎细胞破碎细胞 3 3抽提抽提 4 4分离及纯化分离及纯化 5 5结晶结晶 6 6保存保存 酶的分离纯化酶的分离纯化酶学通论酶的分离纯化酶的分离纯化溶溶解解度度的的差差异异盐析法盐析法PEGPEG沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法

32、等电点沉淀法热稳定性的差异热稳定性的差异热处理沉淀法热处理沉淀法酶学通论电荷性质的差异电荷性质的差异离子交换层析法离子交换层析法电泳法电泳法分子大小和分子大小和形状的差异形状的差异凝胶过滤法凝胶过滤法超滤法超滤法透析法透析法离心法离心法亲和力的差异亲和力的差异亲和层析法亲和层析法疏水作用的差异疏水作用的差异疏水层析法疏水层析法分配系数的差异分配系数的差异双水相系统萃取法双水相系统萃取法酶学通论由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : :1 1全部操作在低温全部操作在低温0 044。 2 2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3 3在

33、提纯溶剂中加一些保护剂，如少量在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTAEDTA、 少量少量-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。 4 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和回收率（得率）。回收率（得率）。 酶学通论酶的纯度：酶的纯度：= = 活力单位数活力单位数/ mL/ mL酶液酶液总体积（总体积（ mLmL） = = 活力单位数活力单位数/ / 毫克蛋白毫克蛋白 = = 每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力= = 100100每次总活力每次总活力第一次

34、总活力第一次总活力酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、分子筛层析等。电泳法、分子筛层析等。酶学通论酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性酶学通论酶的保存酶的保存v低温（低温（04，-20）；高浓度较稳定；加入）；高浓度较稳定；加入稳定剂；固定化。稳定剂；固定化。v最后一步纯化过程得到的酶液，需经浓缩或结最后一步纯化过程得到的酶液，需经浓缩或结晶以及其它处理，以便于保存。在合适的条件晶以及其它处理，以便于保存。在合适的条件下，酶一般可保存较长的时间。下，酶一般可保存较长的时间。 在在4下，可下，

35、可将酶悬浮在浓硫酸铵或将酶悬浮在浓硫酸铵或PEG溶液中保存，溶液中保存，10 mg/ml 的浓酶液可加入的浓酶液可加入25%50%甘油保存。甘油保存。可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用。可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用。v冷冻干燥（冷冻干燥（04）保存，避免反复冻溶。）保存，避免反复冻溶。酶学通论v1982 Thomas R Cech1982 Thomas R Cech从四膜虫发现从四膜虫发现rRNArRNA的自身催的自身催化作用，并提出了核酶（化作用，并提出了核酶（ribozymeribozyme）的概念。）的概念。v核酶的种类核酶的种类催化分子内反应（自我剪接和自我剪切）催化分子

36、内反应（自我剪接和自我剪切）催化分子间反应（催化分子间反应（L19RNAL19RNA、RNaseP)RNaseP)v核酶的研究意义核酶的研究意义v七、核酶（七、核酶（ribozyme)ribozyme)酶学通论 19821982年美国年美国T. CechT. Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNArRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现某些工，发现某些RNARNA有催化活性。有催化活性。 Thomas Cech Thomas Cech University of Colorado University of Colorado a

37、t Boulder, USA at Boulder, USA 酶学通论酶学通论 19831983年美国年美国S.AltmanS.Altman等研究等研究 E.coli RNasePE.coli RNaseP（由（由23%23%蛋白质和蛋白质和77%77%的的RNARNA组成），发现组成），发现RNaseP RNaseP 中的中的RNARNA可催化可催化E.coli tRNAE.coli tRNA的前体加工。的前体加工。 Sidney Altman Sidney Altman Yale University New Yale University New Haven, CT, USA Haven

38、, CT, USA 酶学通论酶学通论酶学通论v抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。v既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为“抗体酶抗体酶(abzyme)”(abzyme)”。因为它是具有催化活性的抗体；故。因为它是具有催化活性的抗体；故又称为又称为“催化性抗体催化性抗体(catalytic antiboy)”(catalytic antiboy)”。v19861986年年 Bichard LernerBichard Lerner和和 Peter SchultzPeter Schultz两个两个小组根据过渡态理论和免疫学原理，运用单克隆小组