M蛋白的检测与鉴定

1、M蛋白的检测与鉴定一、M蛋白的基础知识M蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆大量增殖时所产生的一种异常免疫球蛋白，其氨基酸组成及排列顺 序十分均一，空间构象、电泳特征也完全相同，本质为免疫球蛋白或其片段（轻链、重链等）。由于它产生于单一克隆（发性骨髓瘤monoclone）,又常出现于多（multiple myeloma ）、巨球蛋白血症（macroglobulinemia ）、 恶性淋巴瘤malignantlym phoma ）病人的血或尿中，故称M蛋白。这些M蛋白大多无抗体活性，所以又称为副蛋白（paraprotein）。M蛋白血症可分为恶性与意义不明的两大类。恶性M蛋白血症多见于多发性骨髓瘤（包

2、括轻链病）、巨球蛋白血症、重链病、7Slg M病（Solomen Konkel病）、半分子病及不完全骨髓瘤蛋白病（C端基因缺陷）等。意义不明的M蛋白血症monocl onal gammopathyof un determi ned signifies nee，M G US ） 又分为两种，一种是与其他恶性肿瘤（如恶性淋巴瘤）伴发者，另一种即所谓良性M蛋白血症。M蛋白的检测方法主要有琼脂或琼脂糖电泳、免疫电泳、免疫固定电泳、选择免 疫电泳等。二、M蛋白的鉴定1 多发性骨髓瘤与巨球蛋白血症时的M蛋白检测和鉴定（1）血清总蛋白定量。90%的患者血清总蛋白含量升高（70%的患者100g/L）,约10%

3、的患者正常或甚至偏低（如轻链病时）。2）血清蛋白醋纤膜或琼脂糖电泳。M蛋白在电泳时出现典型的单株峰（亦称M区带），特点是区带窄而浓，扫描时呈现尖高峰，在丫区高比宽2，在B区1。此M区带可因lg的不同而出现在在丫a 2的任何区域。M蛋白增殖的另一特点是其他各区带明显减少，显示图像较简单。有时有的患者血中M蛋并不高，这是由突变细胞的lg分泌能力决定的。这种病人的血清在电泳时M峰可不明显，易被其他蛋白掩盖，需采用稀释血清成应用其 他敏感方法如免疫固定电泳来检测。3）血清lg定量。一般M蛋白所属lg含量均显著增高，其他类lg则正常或显著减低。4）免疫电泳。 正常人血清免疫电泳结果：可分辨出20多种蛋白

4、成分。在阳极端有船形很浓的沉淀线为白蛋白。 通常lg组分靠阴极端，最靠近加样孔者为lg M，依次为IgA、IgG，三者成平滑的连续沉淀线。多发骨髓瘤：多发性骨髓瘤分IgG、IgA、lg M、Igl）和 lgE5 种，IgG 和 IgA 又分亚类，所有lg的轻链又分两个型。因此，免疫电泳时变形沉淀线的位置随各分子的电泳区带不同而异，从慢丫B 2区皆可出现。IgG 1多出现在慢丫区，lgG4在Ba2区。M蛋白与相应的抗重链血清、抗轻链血清形成迁移范围十分局限的浓密的沉淀弧。由于此种病人血清中lg含量甚高，免疫扩散时可出现抗原绝对过剩而不出现沉淀线，此时需稀释血清重做，往往可获得满意结果。巨球蛋白血

5、症：由于IgM分子大量增殖所致。在免疫电泳时，常常出现以下特征：一是沉淀线明显变形。正常情况下，形成短小沉淀线，不 IgM 易看到变形。当IgM大量出现时，则会使整个IgM沉淀线变形。二是抗原孔周围和电泳纵轴出现团块状沉淀。三是电泳时IgM组分无迁移，这多是lg M分子聚合，电泳不移动所致。5）尿本一周蛋白检测。定性检测：用热沉淀法和磺基水杨酸法。 免疫电泳法：用待检尿浓缩后进行免疫电泳，大多数多发性骨髓瘤病人和轻链病患者，仅出现一条致密的弓形弯曲的沉淀线。本法60%80%的骨髓瘤病人和几乎全部轻链病病人可检出尿本周蛋白。 轻锥白蛋白戊二醛交联免疫电泳法：多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症及轻链病

6、可呈阳性，正常人阴性。本法尿本周蛋白检出率为100%，假阳性4%，尿中含有200卩g/ ml时即可出现阳性结果。2重链病时M蛋白检测与鉴定与多发性骨髓瘤相同，免疫电泳时由于重链分子较lg分子小，故迁移率快，电泳位置较靠阳极侧（3a）。但重链病一般需选择免疫电泳证实。3 7Slg M病时M蛋白的检测与鉴定般lg M为五聚体，沉降系数为19S，而7S IgM患者的IgM为单体，沉降系数为7S。证明7S IgM有两种方法：一种是在测定lg M总量后，将被测血清12 ml过Sepharose 6B柱，再根据洗脱峰图用面积仪测出7S lg M占总IgM的百分比，与lg M总量换算即得7S IgM的绝对值

7、。另一方法即为植物血凝素（PHA）选择电泳。此法原理是五聚体lg M可与PHA结合形成沉淀，而单体IgM不与PHA结合。在琼脂胶中加入PHA，后进行电泳，五聚体IgM被PH A所阻留，而7S IgM继续向阳极泳动，并可与随后加至抗体槽中的lg M抗血清反应，形成单一沉淀弧。4半分子病时M蛋白检测与鉴定所谓半分子病（half- molecule ）是指此种M蛋白由一条重键和一条轻链组成，分子量是正常lg分子的1 /2或V 1 /2 （因半分子病肽链往往有部分缺失）。至今报告过IgG和IgA的半分子病。除上述检测方法外，尚须对“半分子”进行特殊鉴定。方法有：免疫电泳法鉴定半分子M蛋白的迁移率。电泳

8、时发现具有IgG或IgA的电泳特征而迁移率明显快于二者时（泳向正极可达a 2区），应注意有无本病的可能。十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳，推算M蛋白的分子量。超速离心分析，测定M蛋白的沉淀系数。Fc抗原决定簇的确定。用相应抗重链血清对比患者与正常人相应lg的区别5测定免疫球蛋白轻链型筛选M蛋白即K型或入型。对于每个lg分子而言,lg分子而言，则有K和入两种链型，。任何原因引起的lg分子多克隆增殖，K /入值不变。而M蛋白发生时，正常人有五类免疫球蛋白，其轻链有两种型， 其轻链只有一种，不是K就是入。但对一个体的 且其比例基本上是固定的，即K/入约为2 : 1如慢性肝病，系统性红斑狼疮

9、、某些恶性肿瘤时，其是单克隆细胞的恶性增殖，所以在lg量明显增高的同时，其k/入比值必然发生改变，即一种轻链型的lg分子增多。利用适当的方法，分别定量测定血清中K、人型lg分子的量，即可特异而简便地诊断M蛋白病。测定方法有两种，一是用浊度测定技术分别测定含K或入的lg的量，一种是用单相免疫扩散法测定K型、入型lg的含量及比值。单扩法是在琼脂凝胶板上打孔，排列呈梅花型，中心孔注入抗K、抗入混合抗体，周围孔放正常人及患者待测血清，然后进行扩散。正常血清与抗血清之间可见对称双线。若患者的K轻链lg升高，其沉淀线向内移，而入线有不同程度向外移，双环间距增宽。若入轻链lg含量增高，则表现为环距减小、融合或跨环现象。此外，该法对IgG、IgA、IgD类型的轻链诊断准确率较高，而对lg M型诊断不够理想，其原因是lg M分子大，扩散迁移率小，同时五聚体立体结构也影响了抗轻链抗体与轻链结合。若用二疏基乙醇处理将lg M解为单体，则阳性率大大提高