酶分子的修饰课件

1、定义定义: :通过各种方法使酶分子的通过各种方法使酶分子的结构结构发生某些发生某些 改变，进而改变酶的某些改变，进而改变酶的某些功能功能和和特性特性的技术。的技术。 酶酶 分分 子子 非必需基团非必需基团 必需基团必需基团 活性中心活性中心 必需基团必需基团 活性中心外活性中心外 必需基团必需基团 结合基团结合基团 催化基团催化基团 非活性中非活性中 心心 活活 性性 中中 心心 与底物相与底物相 结合，使底结合，使底 物与酶的一物与酶的一 定构象形成定构象形成 复合物复合物 影响底物中某些影响底物中某些 化学键的稳定，化学键的稳定， 催化底物发生化催化底物发生化 学反应并将其转学反应并将其转

2、 化成产物化成产物 维持酶活维持酶活 性中心应性中心应 有空间构有空间构 象所必需象所必需 的基团的基团 一、酶分子修饰的目的一、酶分子修饰的目的 (1) 提高酶活力提高酶活力：酶蛋白与大分子修饰剂交联后，：酶蛋白与大分子修饰剂交联后， 修饰剂产生的修饰剂产生的空间障碍空间障碍或或静电斥力静电斥力可能有效阻挡可能有效阻挡 抑制剂对酶的进攻，同时抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖遮盖”保护了酶活性保护了酶活性 部位，部位，使抑制剂和酶活性部位结合的难度增加使抑制剂和酶活性部位结合的难度增加。 (2)增强酶的稳定性增强酶的稳定性：许多修饰剂分子存在多个活：许多修饰剂分子存在多个活 性反应基团，常常可以与

3、酶形成多点交联，使酶性反应基团，常常可以与酶形成多点交联，使酶 分子的天然构象不容易伸展打开，同时减小酶分分子的天然构象不容易伸展打开，同时减小酶分 子内部基团的热振动，增强酶的热稳定性。子内部基团的热振动，增强酶的热稳定性。 一、酶分子修饰的目的一、酶分子修饰的目的 (3) 降低或消除酶的抗原性降低或消除酶的抗原性：酶分子结构上有一些酶分子结构上有一些 aa残基组成的抗原决定簇，进入机体后，就会诱残基组成的抗原决定簇，进入机体后，就会诱 发产生抗体，使酶失活，通过酶的修饰，有些组发产生抗体，使酶失活，通过酶的修饰，有些组 成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，破成抗原决定簇的基团与修饰剂形

4、成了共价键，破 坏酶分子上的抗原决定簇结构，使酶的抗原性降坏酶分子上的抗原决定簇结构，使酶的抗原性降 低甚至消失。低甚至消失。 (4)探索酶的结构和功能的关系探索酶的结构和功能的关系：通过酶分子修饰，：通过酶分子修饰， 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金 属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响， 探讨酶的结构和功能的关系。探讨酶的结构和功能的关系。 二、选择酶分子修饰剂二、选择酶分子修饰剂 特性：特性： (3) 被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离 出来

5、并鉴定。出来并鉴定。 (4)反应程度能用简单的技术测定反应程度能用简单的技术测定 (1)能选择性地与一个能选择性地与一个aa残基反应残基反应 。 (2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 。 修饰剂的要求：相对分子量较大；生物相容性和水溶性好；修饰剂的要求：相对分子量较大；生物相容性和水溶性好； 表面反应活性基团较多；修饰后酶活的半衰期较长；表面反应活性基团较多；修饰后酶活的半衰期较长； 三、选择反应条件三、选择反应条件 修饰反应总是尽可能在修饰反应总是尽可能在酶稳定的条件酶稳定的条件下进行，尽下进行，尽 量量少破坏酶活性功能的必需基团少破坏酶活性功能的必需基

6、团，反应的最终结果是，反应的最终结果是 要得到酶和修饰剂的高结合率及高酶活回收率。要得到酶和修饰剂的高结合率及高酶活回收率。 pHpH是最重要的是最重要的 增加增加pH 提高反应速率提高反应速率 降低降低pH 减小反应速率减小反应速率 反应活性高的修饰剂反应活性高的修饰剂 pH在生理状态下在生理状态下 反应活性较低的修饰剂反应活性较低的修饰剂 需要较高的需要较高的pH 酶的化学修饰酶的化学修饰 酶分子内部修饰酶分子内部修饰 金属离子置换修饰金属离子置换修饰 大分子结合修饰大分子结合修饰 酶蛋白侧链基团修饰酶蛋白侧链基团修饰 氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰 肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰 物理修

7、饰物理修饰 核酶的修饰核酶的修饰 核苷酸链剪切修饰核苷酸链剪切修饰 核苷酸置换修饰核苷酸置换修饰 酶的化学修饰酶的化学修饰 酶分子内部修饰酶分子内部修饰 金属离子置换修饰金属离子置换修饰 大分子结合修饰大分子结合修饰 酶蛋白侧链基团修饰酶蛋白侧链基团修饰 氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰 肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰 物理修饰物理修饰 核酶的修饰核酶的修饰 核苷酸链剪切修饰核苷酸链剪切修饰 核苷酸置换修饰核苷酸置换修饰 一、定义：一、定义：把酶分子中的金属离子换成另外把酶分子中的金属离子换成另外 一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变 的修饰方法。的修饰方

8、法。 关键所在关键所在 用于修饰的金属离子，一般都是二价金属离子：用于修饰的金属离子，一般都是二价金属离子： 如如Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Co2+等 三、金属离子置换修饰的过程三、金属离子置换修饰的过程 1、酶的分离纯化酶的分离纯化 2、除去原有的金属离子除去原有的金属离子 3、加入置换离子加入置换离子 将欲进行修饰的酶经过分离纯化，将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质除去杂质，获，获 得一定纯度的酶液。得一定纯度的酶液。 在纯化后的酶液中加入一定量的在纯化后的酶液中加入一定量的金属螯合剂金属螯合剂，如，如 EDTA等，使酶分子中的金属离子与等，使酶分子中的金属离子

9、与EDTA形成螯合形成螯合 物，通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将螯合物，通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将螯合 物从酶液中除去，此时的酶液呈无活性状态。物从酶液中除去，此时的酶液呈无活性状态。 加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的 金属离子结合后，除去多余的置换离子。金属离子结合后，除去多余的置换离子。 三、金属离子置换修饰酶的作用三、金属离子置换修饰酶的作用 1、阐明金属离子对酶催化作用的影响：、阐明金属离子对酶催化作用的影响： 了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，从而了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，从而 有利于阐明酶的催化作

10、用机制。有利于阐明酶的催化作用机制。 2、提高酶活力：、提高酶活力： 一般一般淀粉酶淀粉酶是杂离子型，即分子中大多数含是杂离子型，即分子中大多数含 有有Ca2+Ca2+，有些分子中则含有，有些分子中则含有Zn2+Zn2+、Mg2+Mg2+或其他离子，或其他离子， 如果将其他杂离子都换成如果将其他杂离子都换成Ca2+Ca2+，则可以提高酶活力，则可以提高酶活力， 并显著提高酶的稳定性。并显著提高酶的稳定性。 三、金属离子置换修饰酶的作用三、金属离子置换修饰酶的作用 3、提高酶的稳定性、提高酶的稳定性 4、改变酶的动力学特性：、改变酶的动力学特性：KmKm、VmVm、pHpH、温度等。、温度等。

11、有的可以使酶活性降低甚至丧有的可以使酶活性降低甚至丧 失，有的却可以使酶活力提高失，有的却可以使酶活力提高 或增加酶的稳定性。或增加酶的稳定性。 一、定义：一、定义：利用水溶性的大分子与酶蛋白的利用水溶性的大分子与酶蛋白的 侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发 生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。 目前应用最广泛的酶分子修饰方法目前应用最广泛的酶分子修饰方法 二二. . 修饰剂：修饰剂： 要求：具有要求：具有较大的分子量较大的分子量、良好的生物相容良好的生物相容 性和水溶性性和水溶性。这样，经修饰的酶，其半衰期。这

12、样，经修饰的酶，其半衰期 较长，活力回收较高。较长，活力回收较高。 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、）、右旋糖酐（右旋糖酐（dextrandextran）、）、 肝素（肝素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。 HOCH2CH2OCH2CH2OH n (1)PEG(1)PEG分子量分子量为为10001000一一1000010000的修饰效果较好，用的修饰效果较好，用 甲氧基甲氧基PEGPEG效果更好。效果更好。 (2)(2)溶解度高，溶于水，也溶于有机溶剂，没有抗溶解度高，溶于水，也溶于有机溶剂，没有抗 原性，也没有毒性，生物相容

13、性好。原性，也没有毒性，生物相容性好。 聚乙二醇聚乙二醇 三、修饰三、修饰：修饰前活化，然后在一定条件：修饰前活化，然后在一定条件 下与酶分子共价结合。下与酶分子共价结合。 1、修饰剂的活化、修饰剂的活化 以以PEG为例，为例，PEG的羟基被活化，与酶的的羟基被活化，与酶的N端端 氨基结合（氨基结合（Lys残基的侧链氨基）残基的侧链氨基） （1 1）三氯均嗪法）三氯均嗪法 PEGPEG经经三氯均嗪活化三氯均嗪活化后，后， 用用石油醚抽提石油醚抽提或或减压蒸馏减压蒸馏，制得活化，制得活化PEGPEG，后，后 者者与酶交联与酶交联，制得修饰酶：，制得修饰酶： （2 2）琥珀酸酐法）琥珀酸酐法 常用

14、二溴代琥珀酸酐在温常用二溴代琥珀酸酐在温 和的和的碱性条件碱性条件下将下将PEGPEG活化活化，经，经减压浓缩减压浓缩制得制得 活化活化PEGPEG，活化，活化PEGPEG与酶分子上与酶分子上氨基氨基发生交联发生交联 反应，而得修饰酶：反应，而得修饰酶： （3 3） 重氮法重氮法 是将是将PEGPEG末端羟基转化为重氮末端羟基转化为重氮 基团基团，再在，再在弱碱弱碱性条件下与酶分子的性条件下与酶分子的酚基、酚基、 咪唑基咪唑基等反应，而生成修饰酶。等反应，而生成修饰酶。 主要反应有以下三种。主要反应有以下三种。 对对硝基苄基氯活化法。硝基苄基氯活化法。 N羧甲氨基苯甲酐活化法羧甲氨基苯甲酐活化

15、法 4氟氟2硝基重氮物活化法硝基重氮物活化法 右旋糖苷右旋糖苷（高碘酸（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷）活化右旋糖苷 四、大分子结合修饰的作用四、大分子结合修饰的作用 1、提高酶活力：、提高酶活力： 一分子一分子RNA酶酶 + 6.5分子右旋糖苷分子右旋糖苷酶活提高酶活提高 为原来的为原来的2.25倍。倍。 一分子胰凝乳蛋白酶一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷分子右旋糖苷酶活酶活 提高原来的提高原来的 5.1倍。倍。 一分子胰蛋白酶一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷分子右旋糖苷酶活提高酶活提高 0.30倍倍 2、增强酶的稳定性、增强酶的稳定性 水溶性的大分子与酶分子共价结合进行酶分子修水

16、溶性的大分子与酶分子共价结合进行酶分子修 饰，可在酶分子外围饰，可在酶分子外围形成保护层形成保护层，起到保护酶的，起到保护酶的 空间构象空间构象的作用，增加酶的稳定性。的作用，增加酶的稳定性。 3、改变酶的抗原性、改变酶的抗原性 通过大分子结合修饰，使酶分子的结构发生变化，通过大分子结合修饰，使酶分子的结构发生变化， 降低或消除酶的抗原性，可以保持酶的催化功能。降低或消除酶的抗原性，可以保持酶的催化功能。 如：精氨酸酶如：精氨酸酶经经PEGPEG结合修饰后，其抗原性显著结合修饰后，其抗原性显著 降低。降低。 色氨酸酶色氨酸酶经经PEGPEG修饰后可完全消除其抗原性。修饰后可完全消除其抗原性。

17、L-L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶经经PEGPEG结合修饰其抗原性完结合修饰其抗原性完 全消除。全消除。 一、定义：一、定义：采用一定方法使酶分子的侧链基团采用一定方法使酶分子的侧链基团 发生改变，从而改变酶分子的特性和功能。发生改变，从而改变酶分子的特性和功能。 侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪 唑基、吲哚基。唑基、吲哚基。 侧链基团修饰剂：采用的各种侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物小分子化合物。 2020种不同氨基酸的侧链基团中只有种不同氨基酸的侧链基团

18、中只有极性极性氨氨 基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。 根据氨基酸侧链根据氨基酸侧链R基的极性，基的极性， 20种氨基酸可分成种氨基酸可分成4类类： 1.1.带正电荷的极性带正电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共3 3种）：种）： 赖氨酸赖氨酸(Lysine,Lys,K), (Lysine,Lys,K), 精氨酸精氨酸(Arginine,Arg,R),(Arginine,Arg,R), 组氨酸组氨酸(Histidine,His,H)(Histidine,His,H) 2.2.带负电荷的极性带负电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共2 2种）：

19、种）： 天冬氨酸天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)(Glutamic acid,Glu,E) 3.3.无电荷的极性无电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共7 7种）：种）： 丝氨酸丝氨酸(Serine,Ser,S), (Serine,Ser,S), 苏氨酸苏氨酸(Threonine,Thr,T),(Threonine,Thr,T), 酪氨酸酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), (Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),(Cyst

20、eine,Cys,C), 天冬酰胺天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),(Asparagine,Asn,N), 甘氨酸甘氨酸(Glycine,Gly,G), (Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)(Glutamine,Gln,Q) 4. 4. 非极性非极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共8 8种）：种）： 丙氨酸丙氨酸(Alanine,Ala,A),(Alanine,Ala,A), 亮氨酸亮氨酸(Leucine,Leu, L),(Leucine,Leu, L), 缬氨酸缬氨酸(Valine,Val,V), (Valine,Val,V), 异亮

21、氨酸异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸色氨酸(Tryptophan,Trp,W),(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸甲硫氨酸(Methionine,Met,M),(Methionine,Met,M), 脯氨酸脯氨酸(Proline,Pro,P)(Proline,Pro,P) 这些基团可以组成各种这些基团可以组成各种副键副键，对酶的空间结，对酶的空间结 构的形成和稳定起着重要作用。如果这些构的形成和稳定起着重要作用。如果

22、这些基团基团发发 生改变，就会引起生改变，就会引起副键副键的改变，使的改变，使空间结构空间结构发生发生 改变，从而引起改变，从而引起酶的特性和功能酶的特性和功能的改变。的改变。 酶分子的侧链基团修饰，可以研究酶分子的侧链基团修饰，可以研究各种基团各种基团 在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能 的影响的影响. .并可以用于研究酶的活性中心的并可以用于研究酶的活性中心的必需基团必需基团。 如果某一基团修饰后不引起酶活力的显著变化，如果某一基团修饰后不引起酶活力的显著变化， 则可以认为这个基团属于非必需基团；如果某一则可以认为这个基团属于非必需基团；如

23、果某一 基团修饰后引起酶活力的显著变化，则可以认为基团修饰后引起酶活力的显著变化，则可以认为 这个基团可能是酶催化的必需基团。这个基团可能是酶催化的必需基团。 一、氨基修饰一、氨基修饰 来源：来源：Lys, Arg, His, GlnLys, Arg, His, Gln 修饰反应：修饰反应：酰基化与烷基化酰基化与烷基化 修饰剂修饰剂: 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNSDNS）、）、 2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）、碘乙酸、碘乙酰）、碘乙酸、碘乙酰 胺、胺、 2 2，4 4，6 6三硝基苯磺酸、亚硝酸等三硝基苯磺酸、亚硝酸等

24、 乙酸酐修饰乙酸酐修饰 2，4，6三硝基苯磺酸修饰三硝基苯磺酸修饰 2，4二硝基氟苯修饰二硝基氟苯修饰(Sanger反应反应) 氨基的烷基化。这类试剂包括卤代乙酸、氨基的烷基化。这类试剂包括卤代乙酸、 芳香卤和芳香磺酸等。芳香卤和芳香磺酸等。 丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS)修饰。修饰。 苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)修饰修饰(即即Edman反应反应) 二、羧基的化学修饰二、羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性较差。 常用常用水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺修饰修饰天冬氨酸天冬氨酸和和谷氨酸谷氨酸。 可定量可定量测定酶分子中羧基的数目测定酶分子中羧基的数目。 + 水溶

25、性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺 三、巯基的化学修饰三、巯基的化学修饰 来源：来源：CysCys 修饰反应修饰反应: :烷基化烷基化 修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸(IAA) (IAA) 碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM)(IAM) E-SH + R-X E-SR +HX N-N-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEMNEM）（常用的专一修饰巯基试（常用的专一修饰巯基试 剂）剂） ESH 四、咪唑基的化学修饰四、咪唑基的化学修饰 来源：来源：HisHis 修饰反应修饰反应: :酰基化与酰基化与烷基化烷基化 酰基化酰基化修饰剂修饰剂: : 常用焦碳酸二乙酯（常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbo

26、natediethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化烷基化修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸 + ICH2COOH + HI 五、吲哚基的化学修饰五、吲哚基的化学修饰 来源：来源：TrpTrp 修饰反应：修饰反应：氧化反应氧化反应 修饰剂：修饰剂： N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂 但解释修饰效果须十分小心，因为：但解释修饰效果须十分小心，因为： 任何一种修饰剂不是绝对专一的。任何一种修饰剂不是绝对专一的。 有些修饰剂引起蛋白质构象变化有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。不

27、一定是活性中心基团被共价修饰。 不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子 内部的必需基团，不易被修饰。内部的必需基团，不易被修饰。 六、交联修饰六、交联修饰 用双功能基团试剂用双功能基团试剂( (如戊二醛如戊二醛) )，与酶分子，与酶分子 内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象 更加稳定。更加稳定。 戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质 的游离氨基反应的游离氨基反应, ,使酶蛋白交联。使酶蛋白交联。 一、定义：一、定义：将肽链上的某一个氨基酸换成另将肽链上的某一个氨基酸换成另 一个氨基

28、酸，引起酶蛋白空间构象的改变，一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变， 从而改变酶的某些特性和功能的方法。从而改变酶的某些特性和功能的方法。 aa是酶的化学结构和空间结构的基础。是酶的化学结构和空间结构的基础。 二、二、aa置换修饰酶的作用置换修饰酶的作用 2、增强酶的稳定性、增强酶的稳定性 1、提高酶活力、提高酶活力 3、使酶的专一性发生改变：、使酶的专一性发生改变： 酪氨酰酪氨酰-tRNA合成酶：催化合成酶：催化Tyr和和 所对应的所对应的tRNA合成酪氨酰合成酪氨酰-tRNA。 该酶的该酶的Thr51若被若被pro置换，酶对置换，酶对 ATP的亲和性提高近的亲和性提高近100倍，酶活倍，酶

29、活 力提高力提高25倍。倍。 T4-溶菌酶：溶菌酶：Ile3被被Cys置换后，置换后，Cys-3可与可与 Cys-97形成二硫键，置换后的形成二硫键，置换后的T4-溶菌酶，溶菌酶， 其活力保持不变，但该酶的稳定性却大大提其活力保持不变，但该酶的稳定性却大大提 高。高。 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶: :活性中心上的活性中心上的SerSer置换成置换成IleIle后，酶后，酶 对蛋白质和多肽的水解活性消失，而出现催化硝基苯对蛋白质和多肽的水解活性消失，而出现催化硝基苯 酯进行水解反应的活性。酯进行水解反应的活性。 三、氨基酸置换修饰的方法三、氨基酸置换修饰的方法 通过两个途径实现：通过两个途径实

30、现： 化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。 定点突变技术定点突变技术：利用基因操纵技术。：利用基因操纵技术。 定点突变技术应用于酶分子修饰的主要过程：定点突变技术应用于酶分子修饰的主要过程： （1 1）新酶分子结构的设计）新酶分子结构的设计 （2 2）突变基因碱基序列的确定）突变基因碱基序列的确定 （3 3）突变基因的获得）突变基因的获得 （4 4）新酶的获得）新酶的获得 （1 1）新酶分子结构的设计新酶分子结构的设计 设计出欲获得的新酶设计出欲获得的新酶RNARNA的核苷酸序列或的核苷酸序列或aaaa序序 列，确定欲置换的核苷酸或列，确定欲置换的核苷酸或aaaa及其位置。及其位置。 （2 2）突变基因碱基序列的确定：突变基因碱基序列的确定： 核酸类酶，根据欲获得的酶核酸类酶，根据欲获得的酶RNARNA的核苷酸排的核苷酸排 列次序。列次序。 蛋白类酶，根据欲获得的酶蛋白的蛋白类酶，根据欲获得的酶蛋白的aaaa排列次排列次 序。序。 同义密码子同义密码子 （3 3）突变基因的