10-液相色谱串联质谱联用技术-实验指导(许煊炜)精编版.doc

1、液相色谱串联质谱联用仪检测技术实验指导（ 2014、2015 级）课程内容（一个实验8 学时）：（1）AB Sciex Qtrap 4500三重四级杆 / 离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。（2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7 种农药的残留量。吉林农业大学农业部参茸质检中心2017.031实验一AB Sciex Qtrap 4500三重四级杆 /离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用一 .实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细

2、致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。（一）检测仪器1、 仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS ）。型号： 4500 QTRAP （美国Applied Biosystems 公司）。2、 仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A ，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500 ，配有 ESI 离子源、串联四级杆/

3、线性离子阱。3、 主要性能指标离子化方式： ESI 电离质量范围：（ 5 1700）amu 分辨率： 6900质量稳定性： 0.1 amu/12h灵敏度： 1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（ m/z : 609/195 ），信噪比 S/N 120:1扫描速度： 4000 amu/sec质量准确度： 0.01% （全质量数范围）4、 方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。 在离子源中，各组分以 ESI 或 APCI 方式电离，被加速后进入质量

4、分析器。4500QTRAP的质量分析器主要由Q1、 Q2、 Q3 三组四级杆串联组成。Q1 可将分子离子按质荷比（m/z ）大小分开； Q2 是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3 具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP 通过串联四级杆 /线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪

5、器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC 计算机 Windows 操作系统支持下的 Analyst 软件控制完成。2（二）样品1、样品要求本仪器适合分子量在5 1700 amu 范围内的有机样品的定性及定量分析。待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液。2、试剂要求所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于18K 。流动相必须用0.2 m或 0.45 m 滤膜过滤后方可使用。3、分离条件要求在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。（三）、操作步骤

6、实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求。1、 开机前准备开机前应检查仪器室内电、气的供应情况及空调机的工作状态是否稳定，检查真空机械泵泵油是否需要更换。只有当UPS 工作正常， Gas1/Gas2、Curtain Gas 和 Exhaust Gas 的压力分别稳定在0.35、 0.35 和 0.7 Mpa ，环境温度为1030，相对湿度小于70%时才能开机。2、开机1) 打开真空机械泵上的电源开关。2) 真空机械泵继续工作至少15 分钟后，打开MS 电源主开关。3) 等真空度达到2 10-5Torr （绿色指示灯不闪）后，打

7、开PC 计算机电源3、仪器调谐（四）、方法建立1.在 Analyst 软件 Tools菜单中选择Project Create Project。在 Project name 项下输入新建的Project名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Project 。2.在 Analyst 软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration 。在弹出窗口中选择MassOnly ，点击 Activate Profile ，激活 MassOnly（只联接质谱主机） 。3.在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的T 钮。此时，应注意

8、到主机有 “扑 ”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击Manual Tuning ，进入质谱参数设置及运行窗口。4.使用 1mL 玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击MS Method 下拉菜单，选择Syringe Pump Method ，设定针泵流速Flow Rate 为 10 L/min。5.点击 Start Syringe Pump 按钮开针泵进样。6.返回 MS Method ，选择扫描模式Scan Type 为 Q1 MS ，设定扫描速度Scan Rate 为 10Da/s，设定扫描范围Start Stop 设定为 50 化合物分子量。DP 预输入

9、60。7.点击 start 开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值3在约 E4 以下。点击stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右键，选择Delete Pane。8.设定 Scan type 为产物离子扫描Product Ion （ Ms2 ），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（ product of ），设定扫描范围 start stop 为 50 MW+20 ，覆盖可能的子离子质量范围，点击 compoud 标签，设定（ DP） 60，（CE） 5。9.点击 start，开始采集数据， 注意观察是否有

10、预期的母离子出现。手动调节 CE，以 5eV 为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。10.选择 Scan Type 为 MRM 。设定参数表格中的 Q1 对应的母离子， Q3 对应的子离子， time（ ms）为 50， ID 值设为名称 1（定量），名称 2（定性）。11.点击 Edit Ramp ，在 Parameter 下选择 Collision Energy ，点击 OK 。点击 start 开始采集数据，记录每个 MRM 通道的最佳 CE 电压。在 MRM 参数设定表中， 右键点击。 选择 Collision Ener

11、gy CE ，调出表格中的 CE 列，输入每个 MRM 通道的最佳 CE 电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在 Parameter 项下选择 Declustering Potential ，优化并保存 DP。完成后选择菜单 File/Save 保存采样方法， 文件名 .dam。（五） LCMS方法的建立：1、连接仪器：打开HPLC 质谱电源，将HPLC 系统接上柱子，将6 号出口管线与离子源连好。调离子源喷雾针位置到2mm 处，双击Hardware Configure ，在硬件配置菜单下单击LCMS (液相与质谱联用)，单击 Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器

12、已经连接上。2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击 Build acquisitionmethod 新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击acquisition method ，模板右边显示对应的参数，确认synchronization mode 选择 LC Sync, 表示液质同步。3、设置 MRM 参数：点击方法模板左侧的MRM,在模板右侧Scan Type 下选择 MRM ；在 polarity下选择化合物极性：Positive( 正离子 )、 Negative （负离子）；Duration 为 15min( 与液相分离相同的时间 )；表格中Q1：母离子

13、分子量，Q3(Da) ：子离子分子量，Time （ msec）： 50，ID 栏：化合物名称（离子对名称后空格加1 为定量，空格加2 为定性），在表格中右键分别单击DP、CE ，点击工具栏的 OPEN 打开之前优化的方法参数，调出DP,CE 值，选中整行，Ctrl+c( 复制 )参数，关闭窗口，再Ctrl+v( 粘贴 )参数）；最后点击 Edit parameter 设置离子源参数： Source/Gas 项用以下推荐值： CUR 35 ， IS:5500( 正离子 ) 或 -4500（负离子）， TEM 600 ， GS1 60， GS270，点击 OK。4、设置液相参数： 点击模板左边的s

14、himadzu LC system ，在右边的pumps 栏下，设置 stop time4（运行时间）为15min， flow 流速为 1mL/min ， A 为水相设为95%， B 为有机相设为5%（设置时改 B， A 自动），泵最大压力为50；点击 time program 设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min)AB-95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接着在右边的 Auto sampler 栏下， 设置清洗时间， 在 Rinse mode 下选择 Before and after( 前后都洗 )，并设置清洗时间为 5s，清洗液用 50%甲醇水。

15、最后点击保存按钮 ,在保存窗口输入该方法的名称。（五）数据处理双击打开Multiquilt ，选择项目，点击File 下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据） ，设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组） ，并指定内标，next，对每个物质进行积分。设置积分参数：CausianSmoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1 或 2；Expeceted Time （保留时间）:一般不动Expected time 范围：一般30s，表示在保留

16、时间15s 范围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物点击 next，点击 finish 。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。 查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。5实验二利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7 种农药的残留量1 实验目的 ：1.1让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析流程。1.2利用前 2 节课所学内容实际处理样

17、品，增强学生实践能力。1.3进一步加强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理。2 试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为GB/T 6682规定的二级水。2.1乙腈 (C 2H 3N) ：色谱纯。2.2氯化钠 (NaCl) ： 140干燥 4 h。2.3氨基固相萃取小柱：500 mg/6 mL( 或性能相当的其它固相萃取柱 )。2.4二氯甲烷 -甲醇混合液 : 二氯甲烷 +甲醇（体积比） = 95 + 5 。2.5标准品： 见表 1。2.6农药标准溶液配制2.6.1标准储备溶液分别准确称取一定量（精确至0.1 mg）农药标准品，用甲醇溶解，逐一配成1000 mg/L 的单一农药标准储备液，密

18、封贮存在-18 冰箱中，使用期为6 个月。表 19 种农药标准品农药名称纯度（ %）多菌灵98吡虫啉98啶虫脒98辛硫磷98阿维菌素98克百威98嘧霉胺982.6.2混合农药标准溶液分别准确吸取一定体积的9 种农药标准储备溶液（ 4.8.1 ）注入同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成 100 mg/L 的混合标准储备液， -18 冰箱中密封闭光保存，使用期为3 个月。2.6.3混合标准工作液6吸取一定体积的混合农药标准储备液， 用甲醇配制成 0.01mg/L 、0.05 mg/L 、0.1 mg/L 、0.2 mg/L 、 1.0 mg/L 、 5.0 mg/L 的 7 种农药混合标准工作液，

19、贮于 4 以下冰箱中，需现用现配。3仪器设备3.1电子天平： 感量 0.01 g；3.2破壁食物料理机：不低于 20000 r/min ；3.3均质机： 不低于 20000 r/min ；3.4恒温水浴锅；3.5旋转蒸发仪；3.6氮吹仪。4 试验步骤4.1样品制备4.1.1鲜人参取不少于500 g 水果于破壁食物料理机中，以不低于20000 r/min的转速将样品制成糊浆状，充分混匀后装入样品密封盒中直接测定或-18 保存，备用。4.2样品预处理4.2.1提取称取 25 g 水果样品 （水果品种当季待定） ，精确至0.01 g，于100 mL 具塞离心管中， 加入 50mL乙腈，于匀质机中高速

20、匀质1 min ，过滤至装有 7g 氯化钠的比色管中，振荡200 下，静止分层，吸取 10mL 上层有机相于50 mL 浓缩管中， 60 水浴中氮气吹至近干，用2 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解残渣，待净化。4.2.2净化氨基柱用5 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解进行预处理，当溶剂液面达上层筛板表面时，再倒入上述浓缩管中待净化溶液，用浓缩瓶接收，待液面下降至上层筛板表面，用8 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解分2 次冲洗浓缩管并洗脱小柱，将浓缩瓶中洗脱液于40 水浴中旋转浓缩至尽干，氮气吹干后用2.5 mL 甲醇和 2.5 mL 水定容，过 0.22 m 滤膜待测。4.3仪器参考条件4.3.1液相色谱串联质谱联用仪: Qtrap 4500 三重四级杆 /离子阱质谱仪 (配岛津 30A 超高效液相色谱仪 )，电喷雾离子源 ,美国 AB SCIEX公司。4.3.2色谱柱： Kinetex XB-C18， 2.1 mm 150 mm 2.6 m4.3.3流动相及流速见表14.3.4色谱柱箱温度： 404.3.5进样体积： 5.0 L7表 1 流动相梯度及流速步骤总时间 /min流速 / （ l/min ）0