生物化学实验复习题

1、生物化学实验复习题：1. 试述旋光法测定淀粉含量的实验原理。2. 在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。在一定的水解条件下，不同谷 物淀粉的比旋光度是不同的。其在171195之间，因此可用旋光法测定粗淀粉的含量。3. 淀粉含量测定的方法有几种比较各方法特点。4. 淀粉是由多个葡萄糖缩合而成的多糖，测定淀粉的方法主要有酸水解法、酶水解法和旋 光法等。5. 1、酸水解法：面粉经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用酸水解淀粉为葡萄糖， 按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量。6. 2、酶水解法：面粉经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用淀粉酶水解成双糖，再用 盐酸将双糖水解成单

2、糖，最后按还原糖测定，并折算成淀粉。7. 3、旋光法：在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。在一定的水解条件下，不同面粉淀粉的比旋光度是不同的。其淀粉的比旋光度在171195之间，因此可用旋光法测定淀粉的含量。8. 简述旋光法测定淀粉的关键步骤。9. 1.样品的处理在电子天平上称取小麦粉置于三角瓶中t加入50ml 1%HCI混成浆状（不能有结块）t沸水浴中准确加热15min t先加1ml 30% ZnSO4混匀t再加1ml 15%亚铁氰化钾混匀t 移至100ml容量瓶中加水定容混匀后过滤t弃去最初15ml收集其余滤液。2. 旋光度测定取滤液 20ml 置于旋光管中， 先用 1%HC

3、l 调节旋光仪“ 0”点，然后将样品溶液放入旋 光仪中测a10. 写出计算粗淀粉含量的公式并说明各符号的含义淀粉含量(%)xl(M)其屮-182.711.衣1- 1不同祚物淀粉的比st比度51种iB fl*iid2小交182.7195.4黑麦184.0小*171.4大立181.3井麦179.5水椚1S5.9181.3A 2 dmFK：样品质岸(g)12. 试述凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理13. 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸

4、溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无 机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相 当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。14. 蛋白质含量测定的方法有几种比较各方法特点。染料法，该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨 基酸组成有较大差异的蛋白质， 有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的， 故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。双缩脲(Biuret)法，此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及

5、干 扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。 因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定 酚试剂法 （Lowry） 法及紫外吸收法双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点， 因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；定氮法 ,双缩尿法（ Biuret 法）、 Folin 酚试剂法（ Lowry 法）和紫外吸收法 .考马斯亮 蓝法（ Bradford 法） .凯氏定氮 灵敏度低 ,适用于氮 , 误差为 2 费时10 小时 将蛋白氮转化为氨 ,用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白

6、质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（ Biuret 法） 灵敏度低 20mg 中速 2030 分钟 多肽键碱性 Cu2? 紫色络 合物 硫酸铵； Tris 缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定 ,但不太灵敏；不同蛋白质显色相 似紫外吸收法 较为灵敏50100mg快速10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm 处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；Folin 酚试剂法（ Lowry 法） 灵敏度高 5mg 慢速 40 60 分钟 双缩脲反应；磷钼酸 磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法（Brad

7、ford法）灵敏度最高5mg快速515分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时 ,其 lmax 由 465nm 变为 595nm 强碱性缓冲液；SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化15. 简述凯式定氮法测定蛋白质的关键步骤。16.1、消化：在电子天平上称取小麦粉置于凯氏试管 底部-加混合混合催化剂和 3ml浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（2h左右）取出放入通风橱内至 不冒白烟，向其中加20ml水，并移至100ml容量瓶定容-即得样品消化液。同时每 4组 8人做 1 空白实验：混合催化剂 +3ml 浓硫酸置于凯氏试管中放入消化炉加热至淡绿色（1h左右）-冷却后加

8、水移入 100ml容量瓶中定容得空白消化液2蒸馏与吸收：吸取10ml 2%的硼酸于三角瓶中-加 4d甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（若变绿色则用L HCl调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并 使管尖插入液面以下， 再吸取5ml消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用 水洗两次，并加入10ml 40%NaOH后 水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至 吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏3min -先移去吸收液再停止加热以防倒吸。3. 滴定：用L HCl滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积。17.写出计算蛋白质含量的公式并说明各符号的含义蛋白质含量（）=21 x

9、 K x woC：标准盐酸溶液摩尔浓度（0.01）, V1S滴定样品用去的盐酸溶液平均話开数璨v0：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平沟亳升数.令W：样品眞屋（mg） o 14.01：氮的原子量。:- K=5.7171=125%V2=100ml18.* V3=5ml19试述淀粉酶活力测定的实验原理20.淀粉酶主要包括a -淀粉酶和卩-淀粉酶两种。a -淀粉酶可作用于淀粉中的a-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，卩-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，生成麦芽糖。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。21.淀粉酶活

10、力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准 曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一 定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，其中主要是a -淀粉酶和卩-淀粉酶。两种淀 粉酶特性不同，a -淀粉酶不耐酸，在以下迅速钝化。卩-淀粉酶不耐热，在70C 15min 钝化。根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化卩-淀粉酶，测出a -淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（a-淀粉酶活力+卩-淀粉酶活力），再减去a -淀粉酶的活力，就可求出卩-淀粉酶的活力。22. 淀粉酶活力测定的方法有几种比较各方法特点。第一种：

11、相同条件下，分别将等物质的量的酶加入适宜条件的淀粉中，然后用 碘液测定第二种：相同条件下，分别将等物质的量的酶加入适宜条件的淀粉中，然后用 斐林试剂进行还原糖的测定23. 简述淀粉酶活力测定的关键步骤淀粉酶活力测定 a -淀粉酶活力测定吸取原液1ml于具塞试管中T 70C保温15min用于钝化卩-淀粉酶-加1ml 1%淀粉置于 40C水浴中保温5min 加1% 一二硝基水杨酸 2ml沸水加热5min后加水至20ml混匀 测A1 （用1#管调零） 总酶活力测定吸取稀释液1ml于具塞试管中加1ml 1%淀粉40C保存5min 加入1% 一二硝基水杨 酸2ml沸水加热5min后加水至20ml混匀测A

12、2 （用1#管调零）24. 写出计算淀粉酶活力大小的公式并说明各符号的含义a -ii粉酹活力抡讣吨X丸数/样品鲜蕈） 5分钟_左少:椭含就3増以淀粉酌除液总体枳（删工）丰羊甜疋（泾）（保:A淀粉fd总活Jj 憂FWft克数/样品鲜农（时，分钟_麦讣術含肚5呼八讹粉原液总体积（mL）x號：故样晶K（g）p-淀粉海活力=（a+p）淀粉胸总活力一*淀”粉酹沾力25.卩-淀粉酶活力=（a + 卩）淀粉酶总活力a-淀粉酶活力麦芽糖含量从标准曲线上查得麦芽糖的毫克数原液体积为100稀释倍数为50规定：40C 5分钟内淀粉酶水解淀粉产生 1mg麦芽糖为1个活力单位（u）25. 试述SDS-PAGE法测定蛋白

13、质分子量的实验原理。26. 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS）,使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。当蛋白质的分子量间时,电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。27. 试比较已做实验测定蛋白质分子量方法的异同点。目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法：该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法

14、测定聚合物的分子量分布。凝 胶过滤层析法：凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，周期短，重复 性能好，条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，而且有时不需要纯物质， 用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。凝胶层析法测定分子量也有一定 的局限性，在pH68的范围内，线性关系比较好，但在极端 pH时，一般蛋白 质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大， 铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法分离速度快、分析时间短、重现性好，进 样量少、自动化程度高。但设备投入较大，价格较高。SDS-凝胶电泳法：实验成本较低，仪器设备也相对

15、很简单，一套电泳装置即可。但是精确程度相对较低，好的电泳图谱需要一定的技术。渗透压法，电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、 光散 射法、超速离心沉降法异；一般凝胶层析是非变性的，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的，所以 是亚基（肽。 凝胶层析与分子形状有关，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与分子形状无关。同；都能分离不同分子量的蛋白质；原理相同SDS-PAGE超速离心凝胶过滤粘度法生物质谱技术28. 简述SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的关键步骤。1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板f将带玻璃条的板 （高板）放置桌面上f在上面放置“ U ” 型橡胶条-最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上

16、，置于电泳槽内，用锲子压紧。2. 凝胶液的制备与灌装：配置 20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入 5ml 30%凝胶储液，10ml PH凝胶缓冲液（用前混匀再取），2ml 1%TEMED，重蒸水，10%过硫酸铵混匀后 f立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿f插上梳子置于35o C培养箱中放置15min，待胶凝后取下“ U ”条f重新将胶板放置于电泳槽内f向外槽内加三分之 一槽深电极缓冲液f向内槽加入电极缓冲液没过低板f最后拔出梳子。3. 加样：用微量进样器加入 10 口 l标准蛋白于中间胶槽内f其余槽内加入10 口 l下列样品牛血清蛋白绿豆分离蛋白4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，

17、低板内侧槽接负极，打开电源f调电流120mA f电泳2h （当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液f测量指示剂迁移距离和染色前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分离6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内f向其中加入%考马斯亮蓝R250使其浸没置于摇床上染色过夜7. 脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。29. 写出电泳法测定蛋白质分子量的计算公式并说明各符号的含义1r计算相对移率t相对迁移率=龍讎決讐韻蠶警2. 以相对迂移率何只为横坐标* Lg師为纵坐标.作出分子量标准曲线。313、求分了屋32试述赖氨酸含量测定

18、的实验原理33. 蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物， 对于提高营养价值有重要意义。 本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法，测定小麦种子中赖氨酸含量。谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的&NH3与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正相关，而其它氨基酸没有自由氨基， 不能发生这一反应。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出 标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。34. 氨基酸含量测定的方法有几种比较各方法特点。常用的有，半定量法：纸层析法；定量法：HPLC柱前

19、衍生化法.1）称干重法可用离心法或过滤法测定优点：可适用于一切微生物，缺点：无法区别死菌 和活菌2）比浊法原理：由于微生物在液体培养时，原生质的增加导致混浊度的增加，可用分光光 度计测定优点：比较准确3）测含氮量，大多数微生物的含氮量占干重的比例较一致，根据含氮量再乘以即可测得其粗蛋白的含量4）血球计数板法优点：简便、快速、直观缺点：结果包括死菌和活菌5）液体稀释法对未知菌样作连续的 10倍系列稀释，经培养后，记录每个稀释度出现生长 的试管数，然后查MPN表,再根据样品的稀释倍数就可计算其中的活菌含量优点：可计算活菌数，较准确缺点：比较繁琐6）平板菌落计数法取一定体积的稀释菌液涂布在合适的固体

20、培养基，经培养后计算原菌液的含菌数.优点,可以获得活菌的信息缺点：操作繁琐，需要培养一定时间才能获得，测定 结果受多种因素的影响35简述测定赖氨酸的关键步骤。1标准曲线的制作（每 2组4人做1标准曲线）2、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦粉 10mg于具塞试管底部t加 1ml 2%碳 酸钠于80C水浴中保温提取 10min t加2ml茚三铜试剂80C水浴中保温 30min后冷却至室 温t加5ml 95%乙醇和5ml蒸馏水充分混匀后转移至离心管中3000转/分 离心3min （离心前必须平衡）t取上清液测 A （以1号管调零）36. 写出计算赖氨酸的公式并说明各符号的含义赖氨酸含量（%）=

21、m 11 10 100W!式中 m=标准曲线上査岀的亮氨酸的量（微克” 为样品的干重（mgoB=0,0537. 试述甲醛滴定法测定氨基氮的实验原理氨基酸为两性离子，在水沼破中有下列平衡=RCHCOO-+2HCHO = RCHCOO-+H+I1NH3+N（CH?OH）?使上述平衡右移促使 NH3+释pH值左右），根据滴定终点常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，放H+，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（ 时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种 已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物, 则

22、只能算出其氨基氮的含量。38. 简述甲醛滴定法测定氨基氮的关键步骤。已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定 ：取3只三角瓶编号2ml 1%甘氨酸2ml 1%甘氨酸2ml水(空白)均加5ml水和5ml中性甲醛(用前加 2滴%酚酞滴加LNaOH调至淡红色)，及4滴%酚 酞混匀t用L滴至粉红色出现为止t分别记下耗去标准碱的体积)39. 写出甲醛滴定法测定甘氨酸的公式并说明各符号的含义。(1) 氨基氮含量Gng/和)=$皿cI(2) 甘氨酸含量 Sg/加二香x(D(3) 甘氨酸含量(g/100诫)二珞xlOO式中r ：滴走祥品所消耗标准吗的平均体积(ml .% 滴定空白所消耗标准的体枳CmD -C：滴定时用

23、标准氢氧化钠的浓度(0.1 moiZL).14.01: Iml Imo/ZLfi氧化钠才搭于氮的JK童(mg) 40. 试述纸上层析法分离氨基酸的实验原理。纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的-OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。 有机溶剂自上而下流动， 称为下行层析； 自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。41. 氨基酸分离的方法有几种比较各方法特点。42. 氨基酸的分离提纯方法主要有沉淀法、离子交换法、萃取法、电渗析等43. 离子交换法 ，根据氨基酸是两性电解质这一特征 ,

24、以及目的氨基酸与杂质氨基酸 pK 、 pI 值的差异 ,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯 化。离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤44. 沉淀法 ，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法， 目前仍在工业上发挥着重大的作用。 氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。沉 淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以 利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂， 使目标氨基酸沉淀， 与其他氨基酸分离， 在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。45. 萃取法 ，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反

25、向微胶团萃取、液膜萃取法 等。其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解 离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有 机相，进而分离氨基酸。溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理 萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。反向微胶团萃取的原理相 对复杂，表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体，它的极性尾在外与非极性的有 机溶剂接触， 而极性头则排列在内形成极性核， 极性核溶于水后就形成了特殊的 “水 池”，当含有氨基酸的水溶液与含反相微胶团的有机溶剂相混合时， 氨基酸以带电离 子状态进入反相微胶团的“水池”内或微胶团球粒

26、的界面分子膜层内而被分离。液 膜萃取是将第三者液体辗成膜状，利用液膜的选择透过性，从而使目标产物透过半 透膜进行分离， 这是一种新型的氨基酸分离法， 常用于乳酸液泡膜分离 L- 苯丙氨酸、 精氨酸等氨基酸。46. 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH 值，使氨基酸带有正负电荷，即当 PH 大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会 带上负电，并且移向正极，相反， PH 值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负 极移动。电透析主要有毛细电透析等方法，通过这种方法可以高效而精确地分离氨 基酸。47. 简述纸上层析法分离氨基酸的关键步骤。1、 平衡：将展开剂（乙醇：水

27、：冰乙酸=50:10:1 ）放入培养皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（24h左右）2、 点样：取滤纸1张用铅笔在距下方 2cm处划线并将所得线段分成 5等分从而得到4个标 记点，用微量进样器分别取 5卩I下列样品phelyspro混合Aa向4个标记点上加样（样 品扩散中？ 1cm）3、 展层：将滤纸卷成筒状且不能够重叠，并用棉线扎紧然后垂直放入培养皿中进行展层2h（当展开剂沿到达滤纸长度三分之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a）4、 显色：用%茚三酮-丙酮溶液朝点样面喷雾 （不要喷得太多）然后将滤纸置于电炉上方20cm处加热直至斑点出现为止，测量各斑点中心到点样点距离（b）48. 影响

28、纸上层析法分离氨基酸的因素有哪些温度，层析液,样品的浓度等1.物质结构对于 Rf值的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水 （固定相）中分配较多，因此 Rf值低于后者。 2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。| | 3. pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于 极性强的一相，这样，改变 pH就会同时改变分配系数，从而使

29、Rf也会相应变化。在氨基酸的层析法中，改变溶剂的pH ,使酸性和碱性氨基酸的 Rf值变动较大，而中性氨基酸的Rf值变动较小。在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的极性降低，从而使Rf值变大，而使碱性氨基酸的Rf变小。反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小，而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的Rf值变大。厂.4.滤纸对Rf值的影响：滤纸本身的 pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。n

30、5.温度对Rf值的影响：Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格， 敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20C至40C，温度改变不超过土C。49. 试述凝胶层析法测定蛋白质分子量的实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法， 主要是根据各蛋白质组分的分子大 小和形状以及所带净电荷多少

31、等因素所造成的电泳迁移率的差别。 在聚丙烯酰胺凝胶系统 中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS）,使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失， 此时， 蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子 量大小。当蛋白质的分子量在间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系。50. 简述凝胶层析法测定蛋白质分子量的关键步骤。1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板T将带玻璃条的板（高板）放置桌面上T在上面放置“U”型橡胶条T最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。2. 凝胶液的制备与灌装：配置 20ml 凝胶液：在小烧杯中依次加入 5

32、ml 30%凝胶储液， 10mlPH凝胶缓冲液，2ml 1%TEMED，重蒸水，10%过硫酸铵混匀宀立即沿高板内侧倒凝胶液 于两板之间直至低板上沿t插上梳子放置15min，待胶凝后取下“ U ”条t重新将胶板放置于电泳槽内t向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液t向内槽加入电极缓冲液没过低板t最 后拔出梳子。3. 加样：用微量进样器加入 7卩I标准蛋白于中间胶槽内t其余槽内加入7卩I下列样品牛血清蛋白绿豆分离蛋白4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源t调电流120mAt电泳2h （当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液t量取指示剂迁移距离和

33、染色剂的前胶长，然后将胶板 置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分离6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内t向其中加入%考马斯亮蓝R250使其浸没置于摇床上染色过夜7. 脱色：用 10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。51. 写出凝胶层析法测定蛋白质分子量的公式并说明各符号的含义1. 计算相对迁移率:相对迁穆率（MR）二2、以相对迁移率M尺为横坐标、Lg伽为纵坐标，作出分子量标准曲线3. 求分子量52. 说明离心机使用时应注意的事项。1离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜；2通常离心机都会有登记表，请在使用前确实登记使用者、转头、转速、时间；3离心管一定要

34、用天平平衡重量（重量平衡），盖上离心管盖子并旋紧；4把平衡好的离心管对称地放入离心陀中（位置平衡），盖上离心陀的盖子， 注意有无旋紧;5完成离心时，要等待离心机自动停止，不允许用手或其他物件迫使离心机停转，待转头完 全静止后，才能打开舱门，请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置， 尽速把上清倒出，小心不要把沉淀弄混浊。6离心机套管底部要垫棉花或试管垫。7电动离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。8离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水 代替。9启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。10离心时间一般12分钟，在

35、此期间，实验者不得离开去做别的事53. 使用分光光度计应注意哪些事项。1. 为了防止光电管疲劳， 不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命2. 取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。3. 比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。54. 操作旋光仪应注意哪些事项旋光仪的使用及注意事项a. 测定前应将仪器及样品置 20C 士 C的恒温室中或规定温度的恒温室中，也可用恒温水 浴保持样品室或样品测试管恒温 lh 以上， 特别是一些对温度影响大

36、的旋光性物质， 尤 为重要。b. 未开电源以前，应检查样品室内有无异物，钠光灯源开关是否在规定位置，示数开关是 否在关的位置，仪器放置位置是否合适，钠光灯启辉后，仪器不要再搬动。c. 开启钠光灯后，正常起辉时间至少 20min，发光才能稳定，测定时钠光灯尽量采用直流供 电，使光亮稳定。如有极性开关，应经常于关机后改变极性，以延长钠灯的使用寿命。d. 测定前，仪器调零时，必须重复按动复测开关， 使检偏镜分别向左或向右偏离光学零位。 通过观察左右复测的停点， 可以检查仪器的重复性和稳定性。 如误差超过规定， 仪器应维修 后再使用。e. 将装有蒸馏水或空白溶剂的测定管，放入样品室，测定管中若混有气泡

37、，应先使气泡浮 于 凸颈处， 通光面两端的玻璃， 应用软布擦干。 测定时应尽量固定测定管放置的位置及方向， 做好标记，以减少测定管及盖玻片应力的误差。f 同一旋光性物质，用不同溶剂或在不同pH值测定时，由于缔合、溶剂化和解离的情况不 同，而使比旋度产生变化，甚至改变旋光方向，因此必须使用规定的溶剂。g. 浑浊或含有小颗粒的溶液不能测定，必须先将溶液离心或过滤， 弃去初滤液测定。有些 见 光后旋光度改变很大的物质溶液， 必须注意避光操作。 有些放置时间对旋光度影响较大的， 也必须在规定时间内测定读数。h. 测定空白零点或测定供试液停点时， 均应读取读数三次，取平均值。严格的测定，应在 每 次测定

38、前， 用空白溶剂校正零点， 测定后， 再用试剂核对零点有无变化， 如发现零点变化 很 大，则应重新测定。i 测定结束时，应将测定管洗净晾干放回原处。仪器应避免灰尘放置于干燥处，样品室内 可 放少许干燥剂防潮。55. 写出凝胶层析法测定蛋白质分子量的仪器组成。每种仪器的作用是什么？56. 电泳仪电泳仪是提供直流电源的装置，它能控制电压和电流的输出57. 电泳槽 电泳槽是电泳涂装作业的主槽58. 作用：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）;非变性聚丙烯酰胺凝胶， 在电泳的过程中

39、，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形 状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。59. 使用电泳仪和安装电泳槽应注意哪些事项。电泳槽的安装：取两块玻璃板t将带玻璃条的板（高板）放置桌面上t在上面放置“U”型橡胶条t最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。电泳槽通电进入工作状态后， 禁止人体接触电极、 电泳物及其它可能带电部分， 也不能到电 泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。电泳仪使用方法1 首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。2 电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及

40、电压电流范围。3 接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电 泳即开始进行。4 工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。注意事项1电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能 到电泳槽内取放东西，如需要应先断电， 以免触电。同时要求仪器必须有良好接地端， 以防漏电。2 仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附 设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。3 由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的

41、电泳不要同时在同一电泳仪上进行。4 在总电流不超过仪器额定电流时（最大电流范围），可以多槽关联使用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。5 某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机， 但在稳流状态下必须先接好负载再开机， 否则电压表指针将大幅度跳动， 容易造成不必要的人为机器损 坏。6 使用过程中发现异常现象， 如较大噪音、 放电或异常气味， 须立即切断电源， 进行检修， 以免发生意外事故。60. 赖氨酸含量测定时，加入 2%Na 2CO 3是什么作用 提供弱酸性环境，茚三酮与 a 氨基酸在弱酸性环境中共热发生反应61. 影响凯式定氮法测定蛋白质含量的因素有哪些分析

42、结果偏低的原因。1、样品消化的完全程度。如：被浓硫酸脱水的样品（有机物），炭化成的氮，由于消化不完全就不能被二氧化硫完全还原成氨，就会造成测定结果偏低。2、消化温度。消化食不能用强火，应保持缓和沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合 物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。3、蒸馏装置的气密性。若气密性差（漏气） ，蒸馏出来的氨气就会挥发流失。 （所以，漏斗 加碱后应立刻水封，以免氨气由此处逸出而造成损失。 ）4、吸收液的温度。硼酸吸收液的温度不应超过40C，否则对氨的吸收作用减弱，而造成氨损失。硼酸吸收液的温度不宜过高，过高则氨的吸收能力将减弱，会影响测量结果，使结果偏低。 最佳方式是

43、保持溶液温度在 20 C以下，或将接收瓶置于冷水浴中。62. 凝胶层析法装柱时应特别注意哪些事项，1 柱填充要均一 ,决不能出现气泡 . 在装柱时候要缓慢倒入凝胶 ,并轻轻敲打柱身赶走气泡 .2 柱上表面要平 ,平衡柱时间要长一些 ,让凝胶充分沉积为均一的柱床 .3 上样体积要少 ,因此最好浓缩样品 .4 柱床上表面不能干燥 , 要有 12cm 流动相覆盖 .63. 影响旋光法测定淀粉含量的因素有哪些试分析结果偏低的原因。64.1) 溶剂的影响 ：旋光物质的旋光度主要取决于物质本身的结构。另外，还与光线透 过物质的厚度，测量时所用光的波长和温度有关。如果被测物质是溶液，影响因素 还包括物质的浓

44、度，溶剂也有一定的影响。因此旋光物质的旋光度，在不同的条件 下，测定结 果通常不一样。因此一般用比旋光度作为量度物质旋光能力的标准2) 温度的影响 ：温度升高会使旋光管膨胀而长度加长，从而导致待测液体的密度降 低。另外，温度变化还会使待测物质分子间发生缔合或离解，使旋光度发生改变。3) 浓度和旋光管长度对比旋光度的影响 ：在一定的实验条件下，常将旋光物质的旋 光度与浓度视为成正比，因为将比旋光度作为常数。而旋光度和溶液浓度之间并不 是严格地呈线性关系，因此严格讲比旋 光度并非常数 .旋光度与旋光管的长度成正 比。旋光管通常有 10cm、 20cm、 22cm 三种规格。经常使用的有 10cm

45、长度的。但 对旋光能力较弱或者较稀 的溶液， 为提高准确度， 降低读数的相对误差， 需用 20cm 或 22cm 长度的旋光管。65.现有一玉米样品，测定其中赖氨酸含量，试设计出实验方案。r I MM 邛电 M * F? Ml(1) 取材帐取烘干s粉辞(过跡仃师的七米粉0”眩(油料种独经脫脂处W -(2) 提取申将称収的样品枚入试管，淮确in入2taL穩慵水摇匀。读讹样晶悬液的总补 駅曲沖于沁用和水恪中熒敢20mhu (7 疋容冷却总 用摊轴水椅试曽屮綸定容至2)P.ksMfiWmmL1P即绘终样品液总疋容体积卅为2DmL,描匀卩(4)过海将撮取液川滤紙过it收集滤液作为特測帕滤紙不能用林水湿

46、润).2林准曲堤制作燉样品测定取9龙刻度试悅 按FSW示顺祸操作，A 11定含适幻剎更-暫号宅白准菴気酸rT厦棒厦惮品011)451I III兗氨酸标准播iml020J0OS1-0輕品请劃液皿)202020農虐水(mL)2.0ts11.42LQ茹三胡试弃IfpiL)各2J0恥各管点匀丿1血30C號滋如芬忡泠却圭京J1逋遭水#mL)定耳車子10eL楼匀比色以0号1为空吕步比测建庄种Ofitn处的眼光區i己录1F芒虞gj66.570纳米处吸光度67. 引起赖氨酸含量测定结果误差的原因有哪些68. 说出凝胶层析法中紫外检测仪，部分收集器，记录仪，恒流泵如何设置参数?69. 紫外检测仪：当档位置于 1

47、00%T时，调光量至数显为 100。当档位置于时 调A数显为0记录仪：设置V纸速=2cm/h部分收集器：设置每10min收集1管，调恒流泵流速使每管收集液体为4ml即V流速=min70. 旋光法测定淀粉时加入亚铁氰化钾和硫酸锌的作用是什么沉淀蛋白质用硫酸锌淀粉样品中原有的和水解后产生的转化糖都具有还原性质，在碱性溶液中能将铁氰化钾还原，根据铁氰化钾的浓度和检验滴定量可计算出含糖量71. 凯式定氮法测定蛋白质时在蒸馏过程中应特别注意哪些事项。蒸馏与吸收：吸取10ml 2%的硼酸于三角瓶中-加 4d甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（若变绿色则用 LHCI调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并 使管尖插入液面

48、以下，再吸取5ml消化液 从漏斗上方加入蒸馏室内用 水洗两次，并加入10ml 40%NaOH后水封（注意：勿 使漏斗内玻杆取下以防漏气）,然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏3min -先移去吸收液再停止加热以防倒吸 。72. 说出通过测定氮来对物质定量的方法，试比较已做过的两种方法的异同点。73. 凯氏定氮法测定蛋白质含量74. 写出纸层析分离氨基酸时，脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸Rf排序，分析其原因氨基酸胚（r 1Rf0.22940.33140.57710.8609在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf。此外，溶剂的

49、溶质的性质、滤纸的性质、展层的温度和p H值均会影响比移值Rf。在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基酸就 相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解 到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸分子，随层析 液向上移动得快，形成的斑点集中在滤纸的上部；而分配系数小的氨基酸分子，随层析 向上移动得慢，形成的斑点集中在滤纸的下面。76. 分析电泳法和凝胶层析法测蛋白质分子量时分子量大小与移动速度的关系。77. 电泳 分子量小、阴电荷多泳动最快；分子量大、阴电荷较少者泳动较慢78.凝胶层析法大分子物质沿凝胶颗粒

50、间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子 物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故 流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得 分离79. 现有一小麦样品，测定其中粗淀粉含量，试设计出实验方案。1样品的处理在电子天平上称取小麦样品10g用捣碎机磨成粉并置于三角瓶中-加入50ml1%HCI混成浆状（不能有结块）-沸水浴中准确加热15min -先加1ml 30% ZnSO4混匀-再加1ml 15%亚铁氰化钾混匀-移至 100ml容量瓶中加水定容混匀后过滤-弃 去最初15ml收集其余滤液。2旋光度测定取滤液20ml置于旋光管中，先用1%H

51、Cl调节旋光仪“ 0”点，然后将样品溶液五、结果计算淀粉含量（）trxlOOK100=182.7放入旋光仪中测a*1-1同甞物愎粗的比厲光度E种畫12,7马静荽IM-(I171.4大走1T9J185,91813玉米叭召1诃L = 2 dni80. 现有一大豆样品，测定其中粗蛋白含量，试设计出实验方案。1、消化：在电子天平上称取大豆样品Xg用捣碎机磨成粉置于凯氏试管底部-加混合混合催化剂和3ml浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（2h左右）取出放入通风橱内至不冒白烟，向其中加 20ml水，并移至100ml容量瓶定容-即得样品消化液。同时每4组8人做1空白实验：混合催化剂+3ml浓硫酸置于凯氏

52、试管中放入消化炉加热至淡绿色（1h左右）-冷却后加水移入100ml容量瓶中定容得空白消化液。2. 蒸馏与吸收：吸取10ml 2%的硼酸于三角瓶中-加 4d甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（若变绿色则用L HCl调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再 吸取5ml消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并加入 10ml 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏 3min -先移去吸收液再停止加热以防倒吸。3. 滴定：用L HCl滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积五、结果计算蛋白质含量（

53、- V 1 x 14 01 V%) 1x x K x 100ff7 (1 - A/ )人-C：标准盐酸溶液摩尔浓度（0.01 L v1：滴定样品用左的盐酸溶液平均亳升数。 % 滴定空白消化液用去的盐战溶液平均呈升数。 W：样品重量（mg） 14.01：氮的原子量。 K=5.7 M=12.5% V2=100ml V3=5ml81. 现有一小麦芽样品，测定其淀粉酶活力，试设计出实验方案。1.标准曲线的制作每2组4人做1标准曲线）编号1班空白）2#3#4#5ShuiuL友芽轄标虺?S *5 7141A -f Z / -V iff（|*；A；Qfb肌心活刀左 J J：f! 0 x 淀*I1 j Ip I 1 0-淀粉酶活力=（口 + fO淀桥酶总活力一口 淀粉酶活力麦芽糖含匮从标准曲线上杳得麦芽糖的毫克数 原液休积为100稀释倍数为50规定 4095分钟内淀粉酶水解淀粉产牛4mg 麦芽糖为