急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义(作者：单位：邮编：)【摘要】目的 观察Livin基因在急性白血病(AL)病人白血病细胞中的表达及其临床意义。方法采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT_PCR)方法检测41例不同时期 AL病人白血病细胞 Livin mRNA的表达水平，以10例健康人作为正常对照。结果 AL病人白 血病细胞Livin mRNA阳性表达率为53.7%。其中急性淋巴细胞白血 病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)病人Livin mRNA阳性表达 率分别为53.8%、53.6%，二者比较差异无显著性，但均高于正常对 照组(10

2、.0%)(P=0.035、0.017)。初治和复发AL病人白血病细胞Livin mRNA阳性表达率分别为52.4%、85.7%，明显高于对照组 (P=0.025、0.004)。缓解组病人Livin mRNA阳性表达率为15.4%， 明显低于初治组和复发组(P=0.004、0.030)，而与对照组相比差异无 统计学意义。白细胞计数50 X109/L的初治白血病病人Livin mRNA 的阳性表达率(77.8%，7/9)明显高于白细胞计数 50X109/L的初治病 人(25.0%，3/12)(P=0.022)，其表达水平也明显高于后者(T=6.50， P0.05)。结论Livin mRNA过度表达

3、参与了 AL的发病，可作为 AL 的诊断、复发及预后判断的指标之一。 Livin mRNA表达在AL细胞 的增殖分化和(或)抗凋亡过程中发挥了重要作用，可能是导致AL细 胞对化疗药物不敏感的原因之一，可作为治疗的一个潜在靶点。【关键词】Livin基因;白血病;逆转录聚合酶链反应ABSTRACT Objective To explore the correlation between the expression of Livin gene in acute leukemic (AL) cells and its clinical significanee. Methods The levels

4、 of leukemic cell Livin mRNA in 41 AL patients and 10 healthy controls were measured by semi Jquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT PCR) technique. Results The positive expression rate of leukemic cell Livin mRNA in the patients was 53.7%, and that of Livi n mRNA in ALL ce

5、lls and ANLL cells were 53.8% and 53.6%, respectively, the differe nee betwee n them was not sig ni fica nt, but higher than that in normal controls (10.0%) (P=0.035,0.017). The expression of Livin mRNA in initially _treated AL patients and the recurre nt was 52.4% and 85.7%, respectively, which was

6、 significantly higher than that in normal controls (P=0.025,0.004). The expressi on of Livin mRNA in patie nts at remissi on was 15.4%, which was lower tha n that in in itiallytreated and recurre nt patie nts(P=0.004,0.030), but there was no statistical significanee as compared with normal controls.

7、 Besides, the initially treated ALpatients with a leukocyte count of at least 50 X109 /L had a significantly higher Livin mRNA expression rate (77.8%,7/9) than that with a leukocyte count of less than 50 X109 /L (25.0%,3/12) (P=0.022). In additi on, the level of Livin mRNA in the former was sig nifi

8、ca ntlyhigher tha n that of the latter (T=6.50,P0.05).Conclusion Overexpression of Livin mRNA invoIves in the pathoge nesis of acute leukemia, which can be used as one of the parametersin the diag no sis,predicti on of recurre nee andprog no sis of the disease. The expressi on of Livin mRNA plays an

9、 importa nt effect on the proliferati on and differe ntiatio n of AL cells, which may be one of the reasons leading to insensitive to chemotherapy of AL cells and be used as a pote ntial target for the treatme nt of the disease.KEY WORDS Livin gene; leukemia; reverse tran scriptase polymerase cha in

10、 reacti on凋亡抑制是肿瘤细胞的一个普遍特性。近年发现的凋亡蛋 白抑制因子(IAP)是一类重要的抗细胞凋亡因子，与肿瘤的发生发展 关系密切。目前，人类IAPs家族中已发现有NIAP、XIAP、CIAP1、 clAP2、survivin、apollon、ILP2 和 Livin 共 8 个成员，其抗凋亡功能 远强于Bc1 2家族，在肿瘤的发病机制中起着重要作用。其中clAPI、 clAP2、survivin等多个IAP家族成员在白血病细胞中高表达，且与 预后相关1 3。Livin是IAPs家族中的一个新成员，有2种异构体（Livin a和Livin B）,特异性表达于人的胚胎组织及大多数

11、人类实体瘤组织， 在分化成熟的正常组织中无表达或低表达46，在肿瘤组织中表达明 显增高，与肿瘤的发生密切相关，可能成为肿瘤基因诊断和治疗的新 靶点7。本研究旨在观察Livin基因在各类急性白血病（AL）病人中表 达水平的变化，并探讨其临床应用价值。1对象与方法1.1研究对象AL病人41例，男16例，女25例;年龄1980岁，中位 年龄52岁。其中急性非淋巴细胞白血病（ANLL） 28例（M2者10例, M3者4例，M4者6例，M5者8例），急性淋巴细胞白血病（ALL） 13 例（L1型5例,L2型8例）。初治病人21例，复发7例，缓解13例。 缓解病人中2例系由初诊病人转化而来。所有初诊ALL

12、病人米用VDP（长春新碱、柔红霉素、泼尼松）或VDCP（长春新碱、柔红霉素、 环磷酰胺、泼尼松）化疗方案诱导治疗；ANLL病人采用HA （高三尖杉 酯碱、阿糖胞苷）或DA （柔红霉素、阿糖胞苷）化疗方案治疗，M3病 人采用全反式维甲酸（atRA）或atRA与三氧化二砷（As2O3）合用，或 以atRA为主，联合应用小剂量 DA或HA方案诱导分化治疗。以 上所有病人的诊断及治疗均参照张之南等8主编的血液病诊断及疗 效标准。选择10例健康人作为正常对照，男4例，女6例;年龄21 57岁，中位年龄41.5岁。1.2标本处理无菌操作取EDTA抗凝的骨髓液2 mL，Ficol液（相对密度1.077)分离

13、单个核细胞，细胞比例大于80%，锥虫蓝拒染率大于99%，取约6 X106个细胞，用PBS液洗涤2次，加Trizol液1 mL, 混匀后-20 C保存，待提取RNA。1.3细胞总RNA提取按Invitrogen公司试剂盒说明书的步骤操作。紫外线分光 光度计测定RNA纯度(A260/A2801.6)，同时进行RNA定量测定。 在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳可见3条清晰亮带，说明所提取RNA完 整。1.4 cDNA 合成取 RNA 5 ，OLigo (dT) primer(0.5 g/L)1 山，用 DEPC 处理水补至12山，于70 C下放置5 min。冰上骤冷后，加5X缓冲 液 4 山，RNA

14、酶抑制剂 20 U，10 mmoL/L dNTPs 2 山，37 C 5 min后加入RevertAid M MuLV逆转录酶 200 U，反应体系20山， 42 C反应1 h，70 C下放置10 min终止反应。1.5 PCR扩增1.5.1引物设计 实验中所用引物根据 Gen Ba nk提供的Livin mRNA 序列(Livin a NM_139317.1;Livin p NM_022161.2)， 由上海生工公司设计合成。Livin a 正义链： 5 TGTCAGTTCCTGCTCCGGT CAA3:反义链：5JCGCACGGCACAAAGACGAT G 3 ，其目的基因的长度为 298

15、 bp。 Livin p 正义链：5TGGGAAGAACCGGAAGAC 3 ，反义链：5 CACGGCACAAAGACGATG 3 ，其目的基因的长度为 263 bpp actin 正义链：5CTGGGACGA CATGGAGAAAA 3 ，反义链：5 AAGGAAGGC TGGAAGAGTGC 3，目的基因长度为500 bp。1.5.2 PCR反应PCR反应体系包括：20 町iol/L的Livin 正、反义链引物各0.5 山，10 mmol/L的dNTPs 1.6 山，10 X缓冲 液2山，Taq DNA聚合酶1 U，RT产物1山，其余以DEPC水 补足至20山。预实验确定产物与循环之间呈

16、线性关系。PCR条件： 95 C预变性5 min ,1个循环;然后94 C变性30 s ,59 C复性30 s， 72 C延伸30 s，35个循环;最后72 C延伸10 min。同时行p act in测 定作为内参照。1.6 PCR产物分析取PCR 产物10 gL与Loading Buffer 2 山 混合，在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，80 V、25 min。阳性结果可见500、298和 263 bp处各有一条亮带，分别为p actin、Livin a口Livin p。紫外线 透射仪观察并照相，照片经Metamorph Imaging Sight软件进行分析 并读取吸光度值，取Livin/

17、 pact in吸光度比值进行半定量，代表mRNA表达水平。各标本重复 2次，取平均值。1.7统计学处理用SPSS 11.5和PPMS 1.59统计软件进行统计学处理。实验数据以率和中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用x 2检验、 Fisher 精确概率检验或秩和检验。2结果 2.1 AL细胞中Livin mRNA的表达41例AL病人白血病细胞 Livin mRNA阳性表达率为53.7%(22/41)。其中ALL病人的阳性表达率为 53.8%(7/13)，ANLL 病人阳性表达率为53.6%(15/28)，二者均高于对照组的10% (1/10)， 差异有统计学意义(P=0.035、0.01

18、7)。但ALL与ANLL比较无统计 学差异。ALL、ANLL病人及对照组Livi n/ (3 act in的半定量结果分别 为 0.171(0.102)、0.087(0.117)、0.010(0.007)，ALL 与 ANLL 病人Livin mRNA 表达水平均高于对照组(H=20.22，d=14.25、14.61， P0.05)。图1为部分病人的电泳结果。M : Marker;、同一初治病人Livin a、隠、同一缓解病人Livin a、憶、同一复发病人Livin a、(、正常对照。图1不同阶段白血病病人Livin mRNA的表达2.2 AL病人不同时期Livin mRNA的表达初治组和复

19、发组病人Livin阳性表达率分别为52.4%(11/21)、85.7%(6/7)，均高于对照组(P=0.025、0.004)。缓解 组病人Livin阳性表达率为15.4%(2/13)，明显低于初治组和复发组 病人(P=0.004、0.030)，缓解组与对照组相比差异无统计学意义。2.3 Livin mRNA 表达与外周血白细胞计数关系将初治白血病病人按白细胞计数分为两组，白细胞计数50 X109/L的白血病病人Livin mRNA阳性表达率(77.8%，7/9)，明显 高于白细胞计数50 X109/L的病人(25.0% , 3/12)(P=0.022);两组Livin/ 3 act in半定量

20、结果分别为 0.086(0.389)、0.038(0.298)，前者表达水 平也明显高于后者(T=6.50，P0.05)。3讨论lAPs家族已发现8个成员，是独立于Bcl_2的抗凋亡蛋白。 lAPs的抗凋亡作用主要通过抑制凋亡蛋白酶的活性而实现。Livin是LIN等根据lAPs同源序列，采用含有BIR 序列的EST克隆，在人胚肾cDNA文库中发现的一个lAPs家族的 新成员。2001年ASHHAB等5明确了 Livin存在2个不同的异构体 Livin a和Livin B，分别由298和280个氨基酸组成。基因定位于染 色体20q13.3。Livin主要存在于细胞质中56。Livin抑制细胞凋亡

21、 作用主要通过其BIR区与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)结合， 抑制Caspases 3/_7和Caspases 9的活性，达到阻断凋亡受体及以 线粒体为基础的凋亡途径而起作用6。有研究报道Livin还可能通过 分解Smac，阻止其对XIAP的拮抗作用，从而间接抑制Caspase来 调控凋亡10。由于Livin a和Livin B两种亚型结构上的差异，体外 研究发现它们表现出不同的抗凋亡活性，虽然两者都能阻断TNF_ a与抗CD95抗体所诱导的细胞凋亡，但在阻断依托泊甙等降解DNA的抗癌药物所诱导的细胞凋亡中，Livin B比Livin a有更强的阻断能 力11113。Livin在

22、胎儿发育过程中的多种组织高表达，在正常成人的大多数终末组织中(除胎盘)低表达或不表达4 5，而在如黑色素瘤、 乳癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组 织中高表达1讪2。ABE等13的研究显示，Livin在骨髓增生异常综合征（MDS）及初治急性髓系白血病（AML）中表达均明显高于正常对照 组，提示Livin在初治白血病中可抑制凋亡。本文结果表明，大部分 AL病人表达Livin mRNA，而且Livin mRNA 表达阳性率和表达水平 在AL病人中均明显高于正常对照组，认为 Livin的异常高表达与AL 的发病有密切关系，与有关文献报道一致13。本研究还对不同类型 AL进行分

23、析，结果显示ALL和ANLL中Livin mRNA的表达均高于 正常对照组，各个亚型之间并无明显差异，推测Livin mRNA的过表达有可能是各类AL的共同发病机制。本文结果还显示，初治及复发 白血病病人Livin mRNA表达率高于对照组，而缓解组与对照组无差 别，说明Livin表达在AL细胞的增殖分化和（或）抗凋亡过程中发挥 了重要作用。本研究还显示，Livin的表达水平在外周血白细胞数50 X109/L的病人中高表达，而外周血白细胞数升高是 AL预后不良的重 要因素。因此，Livin可以作为判断预后的重要指标之一。Livin的高 表达是造成白血病细胞耐药的又一重要因素，具体作用机制有待于

24、进一步研究。有研究结果显示，Livin过表达是白血病细胞耐药的根本原 因14。本文结果也显示，Livin mRNA在初治AL病人表达率明显 高于正常对照组，治疗缓解后其表达率明显下降，复发后表达率又再 次升高，其原因可能与Livin高表达后造成白血病细胞对化疗药物的 敏感性下降有关。目前已有研究结果显示，采用RNA干扰技术对Livin 基因表达进行干预后，细胞对诱导凋亡的药物和射线的敏感性增加11。由此可见，Livin基因有可能成为白血病治疗的一个潜在靶点。【参考文献】1 王艳,林凤茹，陈静,等.凋亡抑制蛋白基因在白血病患者 中的表达及临床意义J.中华血液学杂志,2005,26 : 69769

25、8.2 刘建刚，管洪在，卢伟.急性白血病病人白血病细胞 Survivin 基因的表达及其临床意义J.青岛大学医学院学报，2007,43(4): 302304.3 林茂芳，孟小莉，蔡真，等.抗凋亡基因survivin在急性白血病 细胞表达及临床意义J.中华血液学杂志，2002,5 : 251253.4 GAZZANIGA P, GRADILONE A, GIULIANI L, et al. Expressi on and prog no Stic sig nifica nee of LIVIN, SURVIVIN and other apoptosis Related genes in the

26、progression of superficial bladder can cerJ. Ann On col, 2003,14(1): 8590.5 ASHHAB Y, ALIAN A, POLLIACK A, et al. Two splicing varia nts of a new in hibitor of apoptosis gene with differe nt biological properties and tissue distributi on pattern J. FEBS Lett, 2001,495(1 2):5660.6 LIN J H, DENG G, HU

27、ANG Q, et al. KIAP, a novel member of the in hibitor of apoptosis prote in familyJ. Biochem Biophys Res Commun, 2000,279(3):820 J831.7 SCHMOLLINGER J C, VONDERHEIDE R H, HOAR K M,et al. Mela noma in hibitor of apoptosis protein (ML IAP) is a target for immune mediated tumor destruction J. Proc Natl Acad Sic USA, 2003,100(6):3398 3403.8 张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准M. 3版.北京：科学 出版社,2008 : 219_228.9 周晓彬，纪新强，徐莉.医用统计学软件PPMS 1.5的组成和 应用特点J.齐鲁医学杂志，2009,24(1): 29 J32.10 MA L, HUANG Y, SONG