光合细菌分离筛选与培养

1、光合细菌分离筛选与培养着色菌属或称红硫菌属的分离与纯化培养， 着色细菌与绿菌属一样也是光合细 菌，但它们除了含有叶绿素外，还含有胡罗卜素，而且后者占优势。其细胞除球 形外有柱状，偶有弯曲有荚膜及极生鞭毛，能运动，细胞团块呈深浅不一的红 色或紫红色。在有硫化氢条件下生长时，能氧化硫化氢与硫，累积硫于细胞内， 而绿色硫细菌却沉硫于细胞外。分布在有腐烂藻类植物的海泥和淡水泥中。1 分离培养基成分及其配制，由于此种完全培养基的有些成分不能在高压灭 菌或在高温下不相容必须先制备好基础培养基， 然后把其他成分的无菌溶液加 到冷基础培 养基 中。( 1)基础培 养基： NH4Cl 0.1 克 KH2PO4

2、0.1 克 MgCl2 0.05 克 NaCl 海生种 30 克 淡水种 10 克 琼脂 20 克 水 925 毫升，溶解以上无机盐 于水中，加入琼脂，加热至121C 15分钟，使琼脂溶解，分装于试管或螺旋口 瓶里.121 C蒸汽下灭菌15分钟。不加琼脂可作为液体培养基。(2)无菌碳 酸氛钠溶液：将 NaHCO3 5克加水至 100 毫升，在 121C 蒸汽下灭菌 15 分钟。(3)无菌硫化钠溶液：此液既作为HS的来源，又起脱氧剂作用，若是预先配制， 必须把它保存在没有氧的密闭容器里，否则应在临用前配制。取NS9H0 5克加水至 100 毫升，在 121 C 蒸汽下灭菌 15 分钟( 4)完全

3、培养基：基础培 养基(融化冷至45 C ) 10毫升 NaHCO溶液0.4毫升Na2S9HO 0.2毫升， 依次无菌地如到基础培养基中，混匀后可用。2. 分离与纯化培养( 1)分离培养：在广口玻璃瓶底放一层 0.5-1 厘米厚的混有 腐烂海藻的海泥， 用海水覆盖， 暴露于光下。 直至培养器最靠近光源的壁上长出 红色菌为止。 这些红色生长物通常含有着色菌 它的生长决定于泥中硫酸盐的还 原，和随后释放的HS(2)纯化培养深层试管法：a、选取具有着色菌特 征的红色生长物(已用显微镜检查过细胞形态)，放于一定量的完全培养液中， 混匀。 b 准备一系列深层融化的完全培养基管，并保存在 45 C 水溶中，

4、将 混匀于培养液中的生长物稀释成一系列稀释度。 c 每支试管用经 160 C 灭菌 1 小时的固体石蜡和液体石蜡 1:1 的混合物覆盖，每管盖 2 厘米高。 d 曝光于 25-28 C 下培养， 3-7 天后完全分开的红色菌落出现在较高的稀释度里。选择 一支合适的试管培养物表面灭菌， 切断玻璃，移去管子，然后在无菌的培养皿里， 以无菌操作法把菌落解剖出来。 e. 在无菌的完全培养基里乳化菌落，并在一系 列稀释度中重复以上操作培养，保证纯度。纯培养物可在这些深层琼脂里保存， 2个月移种一次。 琼脂培养基划线法：将红色生长物在完全培养基平板上划 线接种，于厌氧条件下曝光25-28 C,培养4-7天

5、挑出典型菌落，重新划线培 养，直到纯化为止。纯化后可保存在深层完全培养基中红螺菌属的富集培养与分离： 其中包括红色红螺菌（ 或称深红红螺菌）、度光 红螺菌、巨大红螺菌、长形红螺菌、纤细红螺菌（或称细小红螺菌）、棕黄色红 螺菌（或称黄褐红螺菌），此类细菌均生长于水和淤泥中，属厌氧或微嗜氧菌， 在厌氧条件下于光亮中能合成有机物细胞螺旋状盘绕，长度不一，有不等数 蜷曲同种细胞的大小变化很大，有端生丛毛，能运动。细胞内含有菌紫素。菌 绿素和类胡罗卜素等故细菌呈红色、褐红色、绛红色或玫瑰色不一。1富集培养（1）培养基成分及配制： NH4Cl 1.0 克 K 2HPO4 0.5 克 MgCl2 0.2 克

6、 NaCl 0.1克 酵母膏0.1克出0900毫升，将上面各物溶解于水，在121C蒸汽下灭 菌20分钟。分别制备及过滤除菌下列各液： 5克碳酸氢钠加50毫升蒸馏水 溶解。 乙醇或4%丙氨酸.0.1N的磷酸溶液。在基础培养基中加入碳酸氢钠 溶液和 1.5-2.0 毫升乙醇或 50 毫升 4%丙氨酸用 0.1N 的磷酸调 pH 至 7.0（2） 富集培养：最适的接种物是暴露在光下的富含有机物的淤泥。接种时，放淤 泥于50毫升的带玻璃塞的磨口瓶中.酌量放一层。加满培养基，塞好塞于，隔绝空气。 置于30 C的照明箱中培养，培养物放在离照明的 25瓦钨丝灯 4英寸处。 观察 通常在3天内可见到液体培养基

7、里和淤泥曝光的一侧呈 现微红色的生长物。 从微红色处取1毫升的富集培养物，接种于第二瓶的富 集培养基 中，培养 2 天. 2.分离培养（ 1）培养基成分及配制：从上面的富集 培养基 中加酵母膏至 0.2%，及 1.5-2.0 克琼脂（但碳酸氢钠应改为 2 克），制 法同上。另取NcfeS- 9HO 1克，加水10毫升，于121 C蒸汽下灭菌15分 钟，在调 pH 之前将此液加到分离培养基中，分装，灭菌后制成平板或柱状培养 基。（ 2）接种：取富集培养物于分离平板培养基上划线或涂布接种.或用摇管 法于柱状培养基中分离. 后者由于硫化钠在培养基深处把氧气迅速消耗， 很快就 形成厌氧条件。如用前一种

8、分离法， 可用焦性没食子酸和碳酸钠造成厌氧条件. 或于其他的缺氧条件下培养，挑选具有此类细菌特征的菌落.作穿刺接种，管口塞 紧后封蜡，培养，备用。1. 培养基：（1）酵母膏 0.5 g/L NH4C1 1.0 g/L NaAC 3.5 g/L MgCL2 0.1 g/LCaC12 0.1 g/L KH2PO4 0.6 g/L K2HPO4 0.4 g/L PH 7.2-7.4（富集用） （2）酵母膏 1.0 g/L 羟基丁二酸（苹果酸）0.5 g/L NH4C1 1.0 g/L NaAC3.0 g/L NaC1 1.0 g/L NaHCO3.5 g/L K2HPO4 0.2 g/L MgSO4

9、 0.2 g/LPH 7.0-7.2（专利富集用）（3） 酵母膏 0.1g/L NaAC 3.0 g/L （NH4）2SO4 1.0 g/L MgSO4 0.2 g/LNaC1 1.0 g/L KH2PO4 0.3 g/L K2HPO4 0.5 g/L CaC12 0.05 g/LPH 7.2-7.4（分离纯化用） 酵母膏 3 g/L 蛋白胨 3g/L NaC1 10g/L MgSO4 0.5 g/L KH2PO4 0.25 g/LPH 7.2-7.4（计数保存用） （5）酵母膏 0.5g/L NH4C1 1.0g/L NaAC 3.0g/L MgC1 2 0.1g/L NaHCO31.5g/

10、L CaC1 2 0.1g/L NaC11.0g/L KH 2PQ 0.6g/L K 2HPO 0.4g/L 黄腐酸 0.2g/L或苹果酸0.3g/LPH 7.2-7.4（富集分离用）可加促进剂黄腐酸0.1-0.3 g/L乙醇3.0 g/L代替NaAC作碳源PH上升慢（专 利）。 酵母膏 0.1g/L NaAC 3.0g/L 丙酸钠 0.3g/L NaC1 0.5g/L NH4C11.0g/L MgSO4 0.2g/L 蛋白胨 0.01g/L 谷氨酸 0.2/1000g/L K2HPO4 0.3g/L KH 2P（4 0.5g/L CaC1 2 0.05g/L MnC1 2 0.003g/L

11、FeSO4 0.005g/LPH 7.2-7.4 （分离纯化用）（7）NH4Cl0.1g NaHCO30.1g KH2PO40.02g CH3COON0.1-0.5g MgSO4.7HO20.02g NaCI0.05-0.2g 生长因子1 ml微量元素溶液1 ml蒸馏水9 7 mlPH7 . 0 -7.2(8)醋酸钠1. 145g/L、蛋白胨0. 055g/L、碳酸氢钠0. 6g/L、硫代硫酸钠0. 4g/ L、氯化钠0. 3g/ L、硫酸镁0.1g / L、磷酸二氢钾0. 05g/ L。2. 富集培养：2.1采样：淡水、海水、底泥、有机物污染、营养化虾池等2.2富集培养：1-5g 底泥 1m

12、L 水样一层底泥或 15mL 水样 10mL/15 x 150m m 试管 250mL/250mL200mL/250mL 磨口瓶带螺帽或橡胶塞石蜡封面转接 10-15mL石蜡封面转接0.5-1.0ml 菌液细口磨口瓶装满扎好I转接1mL菌液菌液于同样条件下培养于同样条件下培养于25mL/25mL小磨口瓶25C -30 C 7-14 天（海水 1-3 月）连续光照（2000-3000IX ） 40-60W灯泡距离20-50cm,培养基转为红色或紫色 （棕红）。若不出现红色可在富集一次，直到出现红色的培养液。注意事项：转接时一定震荡均匀底泥和水样经曝晒后使用避藻措施：滤光片800nm添加0.05%

13、NaCL绿色蓝色遮阴布遮阴 含氯化物培养基优于硫酸盐。3. 分离纯化紫色非硫菌：生长较快，七天左右移植合适，海水种慢（2-3周）平板混菌单菌落划线一半固体或液体石蜡圭寸面保存/石蜡密封二至三次富集菌液/或双平板直接划线双平板连续光照连续光照连续光照梯度稀释（10-4 10-5 10-6）、深层柱式半固体培养挑单菌落于液体培养重复半固体培养* （0.6%-0.8%琼脂）或双平板培养菌液混合均匀石蜡封面，橡胶塞封好扎紧28C -30 C 7-10 天28C -30 C 7-10天或连续光照60w白炽灯泡.增加一次穿刺接种,表面封蜡距离 30-40cm。连续光照直到培养基中没有杂菌菌落，染色镜检得纯

14、菌株。 注：1. 也可蘸去一环富集液直接化线双平板培养。 白色或杂色为杂菌，紫红色为光合 细菌不同土壤和水样得到不同光合细菌，有杂菌过多无法得单菌落，有时会分离 到藻类2. 光合细菌培养周期较长，培养时采用在大烧杯中放入培养的平皿，周围 放一些加水棉球，盖上玻璃板在培养箱中培养以防干裂。3 可取1mL富集液于10mL半固体培养基中混均培养，当琼脂中出现红色 菌落时，进行单菌落液体培养。4. 商品制剂中光合细菌的分离鉴定及快速培养培养基：固体培养基 （6）液体培养基：蛋白胨 1.5g/L NaC1 0.5g/L NH4C11.0g/L MgSO4 0.2 g/L K2HPO4 0.5g/L Na

15、2CO 5g/LPH 7.2-7.4碳源和电子受体：苯甲酸 柠檬酸钠 乳酸钠 乙酸钠 丙酸钠 甘油 丙酮酸 苹果酸 甲醇 甘露醇 硫代硫酸钠。（2）实验方法：1）厌氧条件建立：双层平板培养基法或厌氧袋法。2）光合细菌的分离纯化：双层平板进行分离，通过观察，挑取红色单菌落，复平板划线得菌株B3o3）菌落及菌体观察：革兰氏染色油镜观察。4）碳源和电子受体利用试验：在每支厌氧管中分别加入各种碳源和电子受体， 然后接种菌株B3光照培养，几天后观察结果。（3）细菌鉴定：据伯和常见细菌系统鉴定手册进行鉴定。（4）B3快速培养条件确定：分别在不同条件下培养，采用分光光度计测定0D值。最大吸收波长确定：以液体

16、培养基为空白光合细菌制剂规摸性培养1. 生产条件1.1营养：淡水型对盐要求0.1%-0.2%，海水型1%-3%紫色非硫菌要求多种生 长因子，多为B族类。淀粉厂废水酒精厂废液均为很好材料1.2 光照：最适 2000-3000IX （勒）40W 60W丁泡（1000lx 左右）距离 25-30cm。光照强度1000-6000IX均可生长，超过4000IX菌液转色快，易老化，附壁碎片 沉淀不易保存。光线不足，速度慢.菌液浅，杂菌易污染1.3温度：最适28C -30 C 5-7天转为棕红色并有少量附壁现象15C -35 C均能生长，达到对数期时间不同.20 C -30 C四至五天达到对数期.35C -

17、40 C三至四天生长旺盛，五天明显抑制，附壁下沉，细胞碎片。1.4PH : 6.5-7.5 培养过程中PH不断上升6.5-8.5 均能生长PH 8.0三天良好，第四天慢（PH上升），八天达峰值PH 9.0显著影响，菌数下降。1.5氧气：光合细菌在微氧条件相对缺氧时生长快，菌体的营养成分相对较高， 其需氧量在0.20.5vvmo种子在玻璃瓶培养时，采用棉塞封口，每天至少摇晃 2次。2. 生产工艺流程：试管菌种 三角瓶种子培养“开放式培养2.1试管培养：2X15mL/15X 150mm活力强，繁殖速度快，菌液鲜艳试管菌种定期转接防止老化2.2 三角瓶培养：2X 400mL/500mL三角瓶，121

18、C 20-30min接种量2%-3% 28C -30 C 5-7天，菌液均匀无沉淀，颜色紫红至棕红色，有菌 液固有的清香味。2.3血清瓶培养（或卡氏罐）：2X8L/10L血清瓶121 C 20-30min接种量5% 连续光照28 C -30 C 5-7天，菌液均匀，转色好，无附壁沉淀碎 片现象。2.4种子培养：6X 20L/20L塑料桶灭菌：容器采用化学灭菌法；0.5L/T水 次氯酸钠水溶液浸泡12-24小时，滤菌 水冲洗二遍即可使用培养基灭菌；卡氏罐培养基灭菌后于无菌室内分装，或所有物料加30-50%水高压蒸汽灭菌分装后滤菌水补齐。接种量：10%-15% 28C -30 C 5-7 天 连续

19、光照2.5开放式培养：2.5.1. 灭菌：25X 20L/20L 塑料桶0.5T暂存罐灭菌，将0.5T滤菌水泵人暂存罐，加入培养物料，充分溶解后分装 于25X 20L塑料桶（化学灭菌）中备用。2.5.2. 培养条件：接种量 20%-30% PH7.2-7.4 28 C -30 C 连续光照 7-9天2.5.3 .发酵管理：a. 摇动：每天至少二次，定时进行防止菌种下沉。b. PH 调节：PH 9.0及时调整（醋酸 盐酸等），PH上升光合菌生长特征。c. 外观：菌液均匀，基本无分层 无附壁 碎片或沉淀现象（光强 温高 退 化菌种等）。颜色由浅红粉红变为棕（深）红色，10-30亿cfu/mL2.5

20、.4.保存期：夏天三个月冬天六个月，保持80%舌力。2.6分段培养法：是提高菌浓度的有效方法一般培养三天后，PH变为8.0左右，补充新鲜培养基后，PH又变为7.0。 可考虑1.0 %食醋。2.7问题与讨论：a.变浅：接种量少，菌种老化杂菌多，PH过高过低，光线不 足，温度过高过低，水硬度大。b.变黑：气温较高季节长期失去光照。c.变绿：多见于高温季节绿硫菌繁殖，连续多次密闭发酵，更换菌种和水源。d. 变灰：接种小，菌种不纯，光线不足，PH过低。2.8光合细菌的成品保存：低温凉爽，每天不低于2小时光照，光合细菌生长惯性，若突然无光照， 5-10 天菌液发臭，刚开始时给一定光即可缓和，逐渐降光照，光合细菌进入稳定期时 在阴凉避光可保存6月之久。附：光合细菌固定方法：1 沸石粉：粒度120目2.