pcr技术的原理及应用VIP

1、 朱海红朱海红浙江大学医学院附属第一医院浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室传染病诊治国家重点实验室感染性疾病诊治协同创新中心感染性疾病诊治协同创新中心1PCR技术的原理及应用技术的原理及应用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

2、35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，杜邦公司Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，

3、并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖。 引物引

4、物引物引物引物引物XXPCR的改进与完善的改进与完善 Mullis最初使用最初使用DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段片段 不耐高温不耐高温 37C下反应下反应PCR技术的改进与完善技术的改进与完善 1988年年Saiki等从温泉中分离的一株嗜等从温泉中分离的一株嗜热杆菌（热杆菌（thermus aquaticus)中提取到中提取到一种耐热一种耐热DNA聚合酶聚合酶Taq DNA聚合酶聚合酶 耐热性耐热性 忠实性忠实性 扩增长度扩增长度 平台期平台期()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的P

5、CRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA

6、片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮

7、扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的扩增效率：的扩增效率：循环数循环数. 扩增子数扩增子数 (靶序列拷贝数靶序列拷贝数)1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824(10亿亿)q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR在医学和科研中的应用在医学和科研中的应用提提 纲纲 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过

8、标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义常常 规规 PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析。进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。测。实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理实时定量实时定量PCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准曲和

9、标准曲线的分析对线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析。定量分析。 如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析三个概念：三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：横坐标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCycle）；）；纵坐标：纵坐标：荧光强荧光强度度 每个循环进行一次荧光信号的收集每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测

10、元件荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光荧光阈阈值值荧光信号荧光信号阈阈值值 （threshold threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到

11、设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t) value 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理在扩增

12、产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: lg X0= - Ct lg(1+Ex) + lg M (3) Lg Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域域值的循环数即值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多

13、，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。Sample实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 绝对定量绝对定量25提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设

14、计及应用实验设计及应用非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - DNA - DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记QQR实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1 1 SYBR Green 法SYBR Green 法q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA， S

15、YBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR Green 5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation温度温度荧光强度荧光强度Tm-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产非特异性产物物Cycle numberFlourescenc 104 102SampleCycle

16、numberLg of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。q Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化反应体系的建立及优化: :1. 1.SYBR Green SYBR Green 使用浓度使用浓度: :太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，荧酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测光信号太弱，不易检测2.2. PrimerPrimer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量

17、不准3.3. MgClMgCl2 2的浓度的浓度: :可以降低到可以降低到1.5mM,1.5mM,以减少非特异性产物以减少非特异性产物4.4. 反应反应Buffer Buffer 体系的优化体系的优化5.5. 反应温度和时间参数反应温度和时间参数: :由酶和引物决定由酶和引物决定6.6. 其他与常规其他与常规PCRPCR相同相同SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green SYB

18、R Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2 2 -TaqMan -TaqMan法法与目标序列互补TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针v 55端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FAMFAM、VICVIC等等 v 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团

19、(Quencher, Q)(Quencher, Q)v 探针完整，探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被QQ基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光， R R与与QQ分开，发荧光分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，（荧光共振能量转移原理，FRETFRET）v TaqTaq酶有酶有 5353外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan TaqMan 法法 PCRPCR反应的建立反应的建立1 1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计： 探针探针TmTm为

20、为68-70 68-70 ，30 bp, 530 bp, 5不能有不能有G G，G G可能会淬灭荧光素，可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp400 bp，引物，引物TmTm为为59-60 59-60 2 2、反应参数的确定：、反应参数的确定： 一般为：一般为：94 94 ，10-20S10-20S 60 60，30-60S30-60S（TaqTaq酶酶5353外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 60 最高）最高） 也可通过温度梯度优化退火温度也可通过温度梯度优化退火温度 72 72 ，45 S45 S，3 3、优化引物和探针浓度：获得最小、优化

21、引物和探针浓度：获得最小CtCt值，最大信号值，最大信号/ /背景比值背景比值 引物浓度：引物浓度：50-900nM50-900nM 探针浓度：探针浓度：50-250nM50-250nM4 4、其他与常规、其他与常规PCRPCR相同相同乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量q目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据q方法：从血液中提取病毒方法：从血液中提取病毒DNADNA，扩增病毒基因，以，扩增病毒基因，以TaqManTaqMan探针进行检测探针进行检测q设置对照：浓度为设置对照：浓度

22、为10106 6、10105 5 、10104 4 、10103 3 的标准样品各一个，设阴性和空白的标准样品各一个，设阴性和空白对照对照q实验步骤：提取实验步骤：提取HBV DNAHBV DNA 设计特异引物设计特异引物 设计设计TaqManTaqMan探针并标记探针探针并标记探针 扩增程序扩增程序q结果：获取血液样品中结果：获取血液样品中HBV DNAHBV DNA的精确的精确copycopy数数利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV数据分析分析结果： HBV DNA的精确copy数为 3.7X105利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测

23、血液中的HBVHBVsamplesampleTaqManTaqMan法法 应用范围应用范围q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q 单核苷酸多态性分析 (single nucleotide polymorphism ， SNP)TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3 3 - Molecular beacon - Molecular beacon 法法(

24、(分子信标分子信标) )标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRETFRET）q 探针与探针与DNADNA杂交时产生荧光杂交时产生荧光 -延伸过程：不产生荧光延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号信号Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 应用范围应用范围 q 起始模

25、板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP分析Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 优缺点优缺点q高特异性：高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点几种方法总结几种方法总结化学试剂化学试剂工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂信号检测信号检测主要应用范主要应用范围围SYBR Green I结合于双链结合于双链DNADNA的小沟中的小沟中否否复性复性/ /延伸延伸熔解曲线分析熔解曲线分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因Molecular Bea

26、con发夹型杂交发夹型杂交探针探针有有复性复性SNPSNP分析分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因TaqMan水解型杂交水解型杂交探针（探针（5 5-3-3外切）外切）有有任何步骤任何步骤SNPSNP分析分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因实时荧光定量实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（浓度（DNA，RNA）病毒病毒DNA或或RNA的拷贝数的拷贝数转基因的拷贝数转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含相对定量

27、：计算初始反应模板的相对含量量差异表达分析差异表达分析芯片评估芯片评估转基因生物的检测转基因生物的检测基因型检测基因型检测实时荧光实时荧光PCR绝对定量方法绝对定量方法unknown104103标准品，标准曲线标准品，标准曲线已知浓度的相应已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释模板，按不同浓度稀释根据实时根据实时PCR反应得到相应的反应得到相应的C(t)，构建标准曲，构建标准曲线线样品样品与标准品同时进行与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的反应得到未知浓度样品的C(t)值值使用实时荧光定量使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势进行绝对定量的优势 敏感性高敏感性高 检测低拷贝数样品：

28、单拷贝检测低拷贝数样品：单拷贝 区分小差异样品：区分小差异样品：24，48，96， 大范围拷贝数样品同时检测大范围拷贝数样品同时检测 100 1010 省时有效省时有效实时荧光相对定量实时荧光相对定量 相对定量的相对定量的目的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题相对定量的问题解决样品材料不均一造成的差别解决样品材料不均一造成的差别解决加样过程中的差别解决加样过程中的差别 内标基因内标基因内标通常是内标通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒它们在细胞中的表达量或在基

29、因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小定，受环境因素影响较小对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个内标基因拷贝内标基因拷贝实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒已知拷贝

30、数的质粒DNADNA和体外转录的和体外转录的RNA RNA 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方法定量方法q 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线曲线q 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）的表达差异（不同时相）v 2 2- -C C（t t）v 双标准曲线法双标准曲线法 TaqMan TaqMan法举例法举例 标记探针标记探针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q Fam Fam标记目标基因探针标记目标基因探针q VIC VIC标

31、记看家基因探针标记看家基因探针TaqManTaqMan法举例法举例 材料准备材料准备q从正常乳腺组织中提取的从正常乳腺组织中提取的总总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 总总RNARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线的质粒用于生成标准曲线TaqManTaqMan法举例法举例 反应程序反应程序 RT-qPCR 反应程序：反应程序：50C,30min95C,15min94C,15sec60C,1minplate read10C,foreverEnd35 more timesTaqManTaqMan法举例法举例

32、 癌症标记物表达癌症标记物表达Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量定量Copies ng/ l Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 XGAPDH95500857301360001308001.45 XTaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量分析定量分析ERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500

33、 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/ 0.011GraphCopies ng/ l Total RNATaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 讨论讨论 通过通过RT-qPCR成功检测了成功检测了ERBB2基因在不同组织的基因在不同组织的 表达差异；在乳腺表达差异；在乳腺癌组织中，癌组织中，ERBB2的表达量是正常水的表达量是正常水平的平的1.8倍。倍。QX 200 微滴式数字PCR介绍 * *Why do Dr

34、oplet Digital?1st Generation2nd Generation3rd GenerationGel ElectrophoresisReal-Time PCRDroplet Digital PCR(qualitative)(indirect quantification) (absolute quantification)End point (0s or 1s)Less sensitive to PCR efficiencyNo standard curveMore tolerant to PCR inhibitorsddPCR improves precision, sen

35、sitivity and reproducibility * *Droplet Digital PCR Workflow Partition reagents and sample into 20,000 droplets Perform PCR on a thermal cycler Count droplets with a positive PCR product (fluorescent) and a negative PCR product Digital readout provides concentration of target DNAMake DropletsPCR DropletsRead DropletsResults“ “X” ” target copies * *微滴的生成微滴的生成现有定量现有定量PCR体系无缝对接：体系无缝对接：引物和引物和T