土壤中放线菌的分离(20210309074149)

1、1/ 5土壤中放线菌的分离实验目的： 1 掌握配制合成培养基的一般方法。2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料：药品：可溶性淀粉、 KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H20、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角 瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊 子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用

2、化学成分 完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、 氮源为 KN03、NaCl、K2/ 52HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 作为无机盐， FeSO4?7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌， 一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的 微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们 从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线 菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培 养基或有机氮培养

3、基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120C热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴 10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的 数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基 上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤：1. 高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g, K2HPO4?3H2O0.5gMgSO4?7H2O0.5g， FeSO4?7H2O0.01g,琼脂 20g,水 1000ml, pH7.27.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边 搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水

4、分至1000ml。112C灭菌20分钟。2. 土壤中放线菌的分离3/ 5（ 1 ）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取 样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取 2 10cm处的土 壤。盛土的容器应是无菌的。将 5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残 根等，土样取回后应尽快投入实验。称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中， 振荡10 20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为 10-2浓度的 菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。 用无菌吸管无菌操

5、作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管 中，并吹吸吸管 23次，使与 9ml 水混匀，即为 10-3浓度的土壤稀释液。依此 类推，直到稀释至 10-5的试管中（每个稀释度换 1 支无菌吸管）。稀释过程需 在无菌室或无菌操作条件下进行。（ 2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌-5-4-5-4取2支1 毫升移液管分别从 10、 10菌悬液中吸取 1 毫升菌悬液， 分别注入编号10、10的培养皿内。将温度为4550C的高氏一号培养基倒入上 述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置 在温暖处（28C左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（ 3）涂布平板

6、法分离土壤中放线菌取 2 套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、 10-5）、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入 已溶化并冷至50C左右的高氏一号培养基1520ml左右，待冷凝成平板。用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.1ml加到一组相应编号（10-5）的高氏一号平板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），再依 次将 10-4 的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开 始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。（4）平板划线法分离土壤中放线菌 取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注

7、入熔化4/ 5的营养固体培养基1012毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分 A、B、C、D 几个区。每组两 个平板培养基。将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在 火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在 火焰旁取少许 10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿 内，在平板培养基的一边，作第 1 次平行划线 67条， 转动培养皿约 70角，用烧过冷却的接种针，通过第 1 次划线部分作第 2 次平行划线，然后再用同样方法，作 第 3 次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成 30 角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养 基

8、划破。（5）培养接种完毕，将平皿放入28 C恒温箱培养7天，观察 平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。（ 6）挑菌落 待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置 4C冰箱中保存。准备实验内容：无菌刮棒打火机酒精灯无菌报纸包（1个）99mL水/三角瓶（玻璃珠）5支移液管3支9mL水的试管培养皿6套枪头（ 1mL/0.1mL）5/ 5高氏一号培养基 500mL（ 150mL三角瓶2个，200mL试管）思考题：1. 检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。2. 观察与记录以下内容。大小形状边缘颜色表面代谢物种类3. 如何区分放线菌和真菌、细菌？放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落 表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢 子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较 大的，可能是大而疏松也可能大而紧密，其他一些跟