酶催化反应动力学课件

1、1 第第1章章 酶催化反应动力酶催化反应动力 学学 基本要求：基本要求： 了解酶反应的特点，掌握了解酶反应的特点，掌握MM方程的推方程的推 导、应用和各种抑制动力学的特征及其应导、应用和各种抑制动力学的特征及其应 用；熟悉复杂酶反应及其失活动力学的处用；熟悉复杂酶反应及其失活动力学的处 理方法。理方法。 MM方程的推导、应用，各参数的意义方程的推导、应用，各参数的意义 及求取。及求取。 重点和难点：重点和难点： 2 第第1章章 酶催化反应动力酶催化反应动力 学学 1.1 酶催化反应概论酶催化反应概论 1.2 简单的酶催化反应动力学简单的酶催化反应动力学 1.3 有抑制的酶催化反应动力学有抑制的

2、酶催化反应动力学 1.4 复杂的酶催化反应动力学复杂的酶催化反应动力学 1.5 反应条件对酶催化反应速率的影响反应条件对酶催化反应速率的影响 1.6 酶的界面催化反应动力学酶的界面催化反应动力学 总结总结 3 1.1 酶催化反应概论酶催化反应概论 国际生物化学协会国际生物化学协会IUB（International Union Biochemistry）按生化反应类型分为）按生化反应类型分为6类：类：氧氧 化还原，转移，水解，裂合，异构，连接酶。化还原，转移，水解，裂合，异构，连接酶。 酶：酶：生物体内活细胞为其自身代谢活动而产生物体内活细胞为其自身代谢活动而产 生的具有催化活性的一类蛋白质。生

3、的具有催化活性的一类蛋白质。 4 l 降低反应的活化能，加快生化反应的速率；降低反应的活化能，加快生化反应的速率； 但不改变反应的方向和平衡关系；不能改变但不改变反应的方向和平衡关系；不能改变 反应的平衡常数，而只能加快反应达到平衡反应的平衡常数，而只能加快反应达到平衡 的速率。的速率。 酶的催化共性酶的催化共性 l 反应前后状态不变：酶在反应过程中，其反应前后状态不变：酶在反应过程中，其 立体结构和离子价态可以发生某种变化，但立体结构和离子价态可以发生某种变化，但 在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复 到原来状态。到原来状态。 5 酶的催化特性酶的催化

4、特性 高效的催化活性高效的催化活性 高度的专一性高度的专一性 酶反应需要辅因子的参与酶反应需要辅因子的参与 酶的催化活性可被调控酶的催化活性可被调控 酶易变性与失活酶易变性与失活 6 高效的催化活性高效的催化活性 酶的分子活力：酶的分子活力：在最适宜的条件下，每在最适宜的条件下，每1mol酶酶 在单位时间内所能催化底物的最大量（在单位时间内所能催化底物的最大量（mol）。）。 酶催化中心活力：酶催化中心活力：在单位时间内，每一个酶的在单位时间内，每一个酶的 催化中心所能催化底催化中心所能催化底 物的量（物的量（mol）。又称为酶的）。又称为酶的 转换数。转换数。 酶活力：酶活力：在特定条件下，

5、每在特定条件下，每1min能催化能催化1umol底底 物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位， 或称国际单位，用或称国际单位，用U表示。表示。 比活力：比活力：指每指每1mg酶所具有的酶单位数，用酶所具有的酶单位数，用U/mg 表示。也可以根据实际情况自定义。表示。也可以根据实际情况自定义。 7 强的专一性强的专一性 专一性（选择性）：专一性（选择性）：一种酶仅能作用于一种物质一种酶仅能作用于一种物质 或一类结构相似的物质进行某一种反应的特性或一类结构相似的物质进行某一种反应的特性 l 绝对专一性：绝对专一性：脲酶脲酶 l 相对专一性：相对专一性

6、：脂肪酶脂肪酶 l 反应专一性反应专一性 l 底物专一性底物专一性 l 立体专一性立体专一性 l 官能团专一性，序列专一性官能团专一性，序列专一性 8 酶反应需要酶反应需要辅因子辅因子的参与的参与 辅酶、辅基、辅底物辅酶、辅基、辅底物 金属离子：金属离子：金属酶（金属为辅基），与酶金属酶（金属为辅基），与酶 为可逆的结合为可逆的结合 Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Mn2+，Co2+， Fe3+，Mo6+等等 9 酶易变性与失活酶易变性与失活 物理因素：物理因素：热、压力、热、压力、UV、X-ray、声波、振荡、声波、振荡、 冻结等冻结等 化学因素：化学因素：酸、碱、丙酮、乙醇、尿

7、素、表面活性酸、碱、丙酮、乙醇、尿素、表面活性 剂、重金属盐、氧化剂等。剂、重金属盐、氧化剂等。 热变性：热变性：Topt 酸碱变性：酸碱变性：（pH）opt 氧化变性：氧化变性：巯基酶（巯基酶（SH酶）易在空气中氧化酶）易在空气中氧化 SH S-S而失活而失活 10 酶反应的特性酶反应的特性 l 条件温和，能耗低条件温和，能耗低 l 反应专一，精制易，体系较纯易于控制，反应专一，精制易，体系较纯易于控制， 产物浓度高产物浓度高 l 立体专一性利于不对称合成、制备自然立体专一性利于不对称合成、制备自然 界没有的新物质界没有的新物质 l 用组合酶、底物完成指定的多步合成转用组合酶、底物完成指定的

8、多步合成转 换反应换反应 优点优点 缺点缺点 l 只能利用底物中部分组分，一般只能在水溶液中进行只能利用底物中部分组分，一般只能在水溶液中进行 l 温和的反应条件也易于微生物繁殖易使酶染杂菌。失活后温和的反应条件也易于微生物繁殖易使酶染杂菌。失活后 难以再生、复性难以再生、复性 l 只限一、二步反应，酶昂贵，较脆弱易变性，失活只限一、二步反应，酶昂贵，较脆弱易变性，失活 11 1.1.2 酶的催化反应机制酶的催化反应机制 o活性部位（活性中心）活性部位（活性中心） o必需基团必需基团 n接触基团接触基团 o结合基团（结合中心）结合基团（结合中心） o催化基团（催化中心）催化基团（催化中心） n

9、辅助基团辅助基团 12 1.1.2.2 酶反应的专一性机制酶反应的专一性机制 o锁钥学说 o诱导契合学说 o过渡态学说 13 1.1.2.3 酶反应的高效性机制 o酸碱催化 o共价催化 o邻近及定向效应 o扭曲变形和构象变化效应 o多元催化与协同 14 酶催化动力学的研究历史酶催化动力学的研究历史 o1897年，年， Buchner成功地用不含细胞的酵成功地用不含细胞的酵 母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存 在于细胞内，并不依赖活细胞。在于细胞内，并不依赖活细胞。 o1902年，年，Henri提出酶与底物作用的中间复合物提出酶与底物作用的中间复合物 学

10、说。学说。 o1913年，年，Michaelis和和Menten提出了酶催化提出了酶催化 反应动力学基本模型反应动力学基本模型-米氏方程。米氏方程。 o1925年，年，Briggs和和Haldane对米氏方程做了修对米氏方程做了修 正，提出稳态学说。正，提出稳态学说。 1.2 简单的酶催化反应动力学简单的酶催化反应动力学 15 Michaelis Michaelis 与与 Menten Menten 发发展出展出酶动力学酶动力学 MichaelisMenten Nelson 酶与酶与 底物结合后，也还可以与抑底物结合后，也还可以与抑 制剂结合。但是中间产物制剂结合。但是中间产物 ESI不能进不

11、能进 一步分解为产物，一步分解为产物， 因此酶活性降低。因此酶活性降低。 1 2 1 3 3 4 4 5 5 k k k k k k k k k E SESE P E IEI ESISEI EISSEI 45 0SEIEIESEECCCCC 0 dt dC dt dC dt dCSEIEIES CsK Csr CsK K C Csr Ckr m I m I I ESSI max, max 2 )()1 ( 46 CsK Csr CsK K C Csr Ckr m I m I I ESSI max,max 2 )()1 ( I I I I I C Krrr K C r maxmaxmax max

12、, 11 )1 ( 1 Csr Km rr Csr Km K C r K C r IISI I I I I SI 111 1 )1 ()1 ( 1 max,max, maxmax 或 47 这类抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。其结构可能这类抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。其结构可能 与底物毫无相关之处。大多数非竞争性抑制剂都是由一与底物毫无相关之处。大多数非竞争性抑制剂都是由一 些可以与酶的活性中心之外的硫氢基可逆结合的试剂引些可以与酶的活性中心之外的硫氢基可逆结合的试剂引 起的。这种起的。这种SH对于酶活性来说很重要，对于酶活性来说很重要， 可帮助维持可帮助维持 酶分子的构象。酶分子的构

13、象。 CsK Csr CsK K C Csr Ckr m I m I I ESSI max,max 2 )()1 ( 如何判断复合物如何判断复合物SEI是否分解为产物？是否分解为产物？ 可通过改变抑制剂的用量并测定底物的反应速率来判断可通过改变抑制剂的用量并测定底物的反应速率来判断 l CI增至某一浓度，反应速率减小至趋于零：不能分解增至某一浓度，反应速率减小至趋于零：不能分解 l 随着随着CI的增加，反应速率趋于定值：能分解为产物的增加，反应速率趋于定值：能分解为产物 48 1.3.3 反竞争性抑制动力学反竞争性抑制动力学 酶仅与底物结合后才能与抑制剂结合酶仅与底物结合后才能与抑制剂结合 如

14、：肼对芳香基硫酸酯酶的抑制作用就属于此类。如：肼对芳香基硫酸酯酶的抑制作用就属于此类。 1 2 1 3 3 k k k k k ESESEP ESISEI 49 CsK Csr r K C CsK Csr r mI I SI I I m SI )1 ( max,max 或 )1/( )1/(maxmax, I I mI I I I K C KmK K C rr mmI ax K r K r maxIm 50 )1 ( 111 maxmaxI I SIK C rCsr Km r )1 ( max I I m SI K C CsK Csr r 51 各种抑制的比较各种抑制的比较 )1 ()1 (

15、max IS I m IS I SI K C CsK K C Csr r KISKSI：非竞争性抑制：非竞争性抑制 KIS：反竞争性抑制：反竞争性抑制 KSI：竞争性抑制：竞争性抑制 52 53 S SI S SIS r r r rr i 1 maxmax 11/() (1) SIsI Sc SmIsm II m rrCrCsC iCi Cs rKC KCs KC K II I CK C i (,) (1) I Su m II C iCi K KC Cs 抑制百分数：抑制百分数： 竞争性抑制：竞争性抑制： 非竞争性抑制：非竞争性抑制： 反竞争性抑制：反竞争性抑制： 54 1.3.5 底物抑制动

16、力学底物抑制动力学 E+SES E + P k+1 k -1 k +2 S+ES SES k +3 k-3 稳态法：稳态法： :0,0 : ESSES EOEESSES dCdC dtdt CCCC 由拟稳态假定 酶物料衡算 3 3 max /(1), SI sI ms ss s KCk rrK CKk , max , 0 S opt s s optmsI s C dr CK K dC 由解得 55 1.3.6 不可逆抑制动力学不可逆抑制动力学 2 * S I i K k K k ESESEP EIEIEI 类似非竞争抑制动力学，有机磷农药也是基于不可逆抑制作用 56 例例1-4：在含有相同酶

17、浓度的五个反应物系中，分别加入：在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入 不同浓度的底不同浓度的底 物，并测定其初始反应速率，然后再在同物，并测定其初始反应速率，然后再在同 样五个反应物系中分别加样五个反应物系中分别加 入浓度为入浓度为2.210-1mmol/L的抑的抑 制剂，并测其初始反应速率，其数制剂，并测其初始反应速率，其数 据见下表：（据见下表：（P24) 试根据试根据上述数据上述数据决定其抑制类型及动力学参数值。决定其抑制类型及动力学参数值。 57 Csr K r mI11 r 1 maxmaxSI I I m m I I mmIC K K K K C KK)1 ( LmmolKL

18、mmol K C KK LmmolKLmmolr I I I m m m I /27. 0,/44. 0)1 ( /24. 0min),/(100 max 并得到 根据图得 【解】：以【解】：以L-B作图法来判断抑制类型并求其参数（用作图法来判断抑制类型并求其参数（用Excel作图）作图） 根据L-B图形可知为竞争性抑制 58 例例1-5：某酶的：某酶的Km值为值为4.710-5mol/L ，如果，如果rmax值值 2.2105mol/(Lmin) ， 在底物浓度为在底物浓度为210-4mol/L和和 在在(1)竞争性抑制剂与竞争性抑制剂与(2)非竞争性抑制非竞争性抑制 剂的浓度均为剂的浓度均

19、为 510-4mol/L情况下，其反应速率分别为多大？假定情况下，其反应速率分别为多大？假定 在上述情况下在上述情况下KI值均为值均为310-4mol/L ，则在上述两种，则在上述两种 抑制情况下的抑制情况下的 抑制程度各有多大？抑制程度各有多大？ maxmax 11/0.24 (1) SIsI SmIsm iI m rrC rCsC i Cs rKC KCs KC K 0.625 I II C i KC 竞争性抑制：竞争性抑制： 非竞争性抑制：非竞争性抑制： 59 1.4 复杂的酶反应动力学复杂的酶反应动力学 1.4.1 可逆酶催化反应动力学可逆酶催化反应动力学 22 sp ESEP dcd

20、c rk ck c c dtdt 某木糖催化葡萄糖为果糖的反应至一定程度即达到某木糖催化葡萄糖为果糖的反应至一定程度即达到 平衡，平衡，其机理可认为是其机理可认为是 1 1 2 2 kk kk SEESEP 60 ,max max ()() 1 p p sp mp s mp rr CC KK r CC KK , max 1 2 1 2 12 1 1 2 maxmax p EoEo m pm k rk Crk Cr k kk K k k KK k ， 由稳态及酶衡算得由稳态及酶衡算得: 12 max,max 12 /() eq eq p eppm s c k k KrKrK ck k 61 ma

21、x, , , 1 ()() () () eq P ss eq eqPm eqps eqmP ss eq Pm K K rCC KKK KKCK K CC KK 由稳态及酶衡算得: m ax ()() 1 p p sp mp s mp rr CC KK r CC KK max , s ms rC KC 62 maxmax 1 () eq P eqPm K K rr KKK 63 1.4.2 双底物酶催化反应动力学双底物酶催化反应动力学 1.4.2.1 随机机制随机机制 两个底物两个底物S1和和S2随机地与酶结合，产物随机地与酶结合，产物P1和和P2也也 随机地释放出来。随机地释放出来。 521S

22、 ESsCkr 2 1 1 2 5 , , 1212 34 12212121 34 1212 k k k k k ESESESES kk ESSES SESSES S kk ES SEPP 64 如 2 S C为常数，则 12 1max, 2 1 sms SS S cK Cr r 式中： 1 2,maxmax32max5 1 2422321,maxmax41 1 131141 /(1), (1/)/(1/),(1/) , (1/)(1/) i sSEOi i msssss msss k rrK Crk CK k KKKcKCrrKC KKKCKC 如 2 1ss CC均为变量则: 1 1 1

23、2 3 1 4 max )1 (1 ( sss s C K C K C K rr 65 1.4.2.2 顺序机制（顺序机制（大部分脱氢酶）大部分脱氢酶） 两个底物两个底物S1和和S2与酶结合成复合物是有顺序的，酶先与酶结合成复合物是有顺序的，酶先 与底物与底物 S1结合形成结合形成ES1复合物，然后该复合物复合物，然后该复合物ES1 再与再与S2结合形成具有催化活性的结合形成具有催化活性的ES1S2。按同样推导。按同样推导 方法求出下述方程式：方法求出下述方程式： 21 1 2 2 1 1 max 1 ss msm s ms s ms CC KK C K C K r rs 式中：式中：KmS1

24、为单底物时的米氏常数，为单底物时的米氏常数，mol/L; Kms1S2浓度饱和时，浓度饱和时，S1的米氏常数，的米氏常数，mol/L; Kms2S1浓度饱和时，浓度饱和时，S2的米氏常数，的米氏常数，mol/L; 12 12 3 111212 1212 , kk kk k ESESESSES S ES SEPP 66 1.4.2.3 乒乓机制乒乓机制 67 1.4.2.3 乒乓机制乒乓机制 S1、S2始终不同时与酶结合，其机理可表示为（始终不同时与酶结合，其机理可表示为（E*为为 修改过的酶）：修改过的酶）： 2 2 1 1 max 1 s ms s ms s C K C K r r E +

25、S1ES1ES1E* + P1 k+1 k-1 k+2 E* + S2E*S2E*S2E + P2 k+3 k-3 k+4 68 o变构酶又称为调节酶，它是一种寡聚酶。这类酶具有变构变构酶又称为调节酶，它是一种寡聚酶。这类酶具有变构 部位和活性部位。部位和活性部位。 o当底物分子与这类酶结合时，能诱导酶的结构改变，增加当底物分子与这类酶结合时，能诱导酶的结构改变，增加 酶与底物的结合能力，表现出底物对酶的激活效应。酶与底物的结合能力，表现出底物对酶的激活效应。 n变构酶的作用机理十分复杂。已提出的模型有渐变模型，变构酶的作用机理十分复杂。已提出的模型有渐变模型， 同构模型等。同构模型等。 n对

26、变构酶催化反应动力学的描述通常采用的是对变构酶催化反应动力学的描述通常采用的是Hill方程，方程， 可表示为：可表示为： 69 1.4.3 变构酶催化反应动力学变构酶催化反应动力学 底物分子与这类酶结合时能诱导酶的结构改底物分子与这类酶结合时能诱导酶的结构改 变增加变增加E与与S的结合能力，表现出的结合能力，表现出底物对酶的底物对酶的 激活激活效应。效应。 Hill经验公式：经验公式： max /() nn ssHs rr ckc n EnSES 有磷酸果糖激酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、 苏氨酸脱氢酶等 底物分子与这类酶结合时能诱导酶的结构改底物分子与这类酶结合时能诱导酶的结构改 变增加变增加E与

27、与S的结合能力，表现出的结合能力，表现出底物对酶的底物对酶的 激活激活效应。效应。有磷酸果糖激酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、 苏氨酸脱氢酶等 70 max lglglg s s sH r nCK rr 71 1.5 反应条件对酶反应速率的影响反应条件对酶反应速率的影响 l 内部因素：内部因素：酶的结构特征，底物的结构酶的结构特征，底物的结构 特征。特征。 l 外部因素外部因素：pH、T、P、离子强度、各种、离子强度、各种 物质的浓度因素物质的浓度因素 72 1.5.1 pH值的影响值的影响 酶分子上有许多酶分子上有许多酸性和碱性的氨基酸侧链基酸性和碱性的氨基酸侧链基 团团，如果酶要表示其活性，则这些

28、基团必须，如果酶要表示其活性，则这些基团必须 有一定的有一定的解离形式解离形式。 随着随着pH的变化，这些基团可处在的变化，这些基团可处在不同的解不同的解 离状态离状态，而具有催化活性的离子基团仅是其，而具有催化活性的离子基团仅是其 中一种特定的解离形式，因而随着中一种特定的解离形式，因而随着pH值的值的 变化，具有催化活性的这种特殊的离子基团变化，具有催化活性的这种特殊的离子基团 在总酶量中所占的比例就会不同，因而使酶在总酶量中所占的比例就会不同，因而使酶 所具有的催化能力也不同。所具有的催化能力也不同。 73 Michaelis对对pH与酶活力的关系提出三状与酶活力的关系提出三状 态模型的

29、假设：态模型的假设： EH2 -H+ +H+ E2-EH- -H+ +H+ 74 75 1.5.2 温度的影响温度的影响 在适宜的温度内，酶在适宜的温度内，酶 催化反应速率常数中催化反应速率常数中 的的k+2与温度的关系符与温度的关系符 合合Arrhenius方程，即：方程，即： k+2 = Aexp(-Ea/RT) 76 k+2 = ATexp(-H*/RT) 根据根据Eryring的过渡态理论：的过渡态理论： Ks = Aexp(-H/RT) s sEo s c RT H A cc RT H TA r exp exp * 77 1.5.3 酶的失活动力学酶的失活动力学 酶是一种不稳定的物质

30、，常因酶是一种不稳定的物质，常因温度、温度、pH等因素的等因素的 影响而产生不可逆的活性下降。一般是胞外酶较稳影响而产生不可逆的活性下降。一般是胞外酶较稳 定，而胞内酶在外部环境中容易失活。酶在保存和定，而胞内酶在外部环境中容易失活。酶在保存和 参与反应时均有可能失活，前者的失活又称为参与反应时均有可能失活，前者的失活又称为稳定稳定 性性。在使用时酶的失活对于酶催化反应过程的设计。在使用时酶的失活对于酶催化反应过程的设计 和控制都是十分重要的。其中酶的和控制都是十分重要的。其中酶的热失活热失活，或称，或称热热 变性变性是最重要的一种酶失活形式。下面主要讨论此是最重要的一种酶失活形式。下面主要讨

31、论此 种失活动力学。种失活动力学。 78 未反应时酶的热失活动力学未反应时酶的热失活动力学 测定酶在未反应时的热稳定性方法：测定酶在未反应时的热稳定性方法：在一定条件下，在一定条件下， 使酶溶液恒温保持一定的时间，然后再在最使酶溶液恒温保持一定的时间，然后再在最 适宜的适宜的 pH和温度下测定残存的酶活力，即残存酶活。和温度下测定残存的酶活力，即残存酶活。 79 E D kd kr DrEtd Et CkCk dt dC )(exp 0 tkkkk kk C Crddr rd E Et cEocEt + cD )exp(0tkCCdEEt 对于可逆的：对于可逆的： 对于不可逆的失活反应，对于不可逆的失活反应，kr=0，因此：，因此： 80 反应时酶的热失活动力学反应时酶的热失活动力学 酶在反应中的稳定性称为酶在反应中的稳定性称为操作稳定性操作稳定性。在酶催化反。在酶催化反 应时，由于底物和产物的存在，使酶的稳定性或者应时，由于底物和产物的存在，使酶的稳定性或者 得到增强，或者又有所减弱。得到增强，或者又有所减弱。 81 1 21 ESEfEt m Et m m d t CCC k kk K C CsK CsK k dt dCE l 1时，底物对酶失活没有影响时，底物对酶失活没有影响 l 0时，酶完全被底物所保护，时，酶完全被底物所保护，ES完全不失完全不失